تطبيق تكنولوجيا كريسبر على خلايا مُحدّدة في الثقافة لأغراض البحث

مقدمة إلى شركة CRISPR-Based Cell Engineering

وقد تحولت تكنولوجيا التكرارات القصيرة الأجل المجمَّعة بصورة منتظمة بين الفضاءات بصورة أساسية إلى كيفية التلاعب بالجيل من الخلايا الثقافية، ومن خلال تمكينها من تطبيق مواد نووية دقيقة وقابلة للبرمجة في أي موقع تقريبا في جينوم أوكومي، تتيح نظم CRISPR للعلماء إنشاء خطوط خلوية متجانسة، وإجراء فحوصات جينية وظيفية، وبناء نماذج دقيقة للأمراض في مكان آخر.

وتقدم هذه المادة استعراضا تقنيا شاملا لتطبيق نظام " كريسبار " على تعديل الخلايا الثقافية، وتغطي العناصر الأساسية في برنامج CRISPR-Cas9، والبروتوكولات المفصلة المتعلقة بالتسليم والاختيار، واستراتيجيات التحرير المتقدمة، والأخطار المشتركة، والابتكارات الناشئة التي تدفع الميدان إلى الأمام، والهدف هو إعطاء الباحثين الجدد ذوي الخبرة دليلا عمليا وقابلا للإنتاج لاستخدام برنامج البحوث المتعلقة بالتنوع البيولوجي في تدفقات العمل المتعلقة بثقافة الخلوية.

العناصر الأساسية لمؤسسة CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 consists of two essential molecules: a Cas9 endonuclease and a single guide RNA (sgRNA) The sgRNA contains a 20-nucleotide spacer sequence that is complementary to the target DNA region, followed by a scaffold that binds Cas9. For Cas9 to cut, the target DNA must be immediately followed by a short protospace mot

ويمكن للباحثين تصميم نظام تقييم الاحتياجات من الموارد البشرية باستخدام أدوات مثل CHOPCHOP] لتحقيق أقصى قدر من النشاط على الأهداف والتقليل إلى أدنى حد من الإمكانات غير المستهدفة، ثم يتم إصلاح هذا المصطلح باستخدام مسارين محليين هما: الإصدار النهائي غير المتجانس، وهو أمر معرّض للخطأ ويستحدث صيغاً أو اختيارات دقيقة (البيان الثاني).

NHEJ: knockouts and Indel Mutations

وبالنسبة لمعظم الدراسات المتعلقة بخسائر العمل، فإن المعهد الوطني للإحصاء هو الطريق المفضل، إذ إن الخلايا، من خلال تسليمها كايس 9 وجهازاً للفحص الوطني يستهدف ازدراء الترميز، يولد الباحثون مزيجاً من الأدلّة التي تسبب طوقابير أو عصيان للتوقف قبل الأوان، وبعد فترة للتعافي، تُستنسخ الخلايا وتُتَّت للتحقق من الارتباك، ويُستخدم هذا النهج على نطاق واسع لخلق جميعاً لاغياً في خطوط الإشارة الخلوية في خطوطاً للكشف عن الحساسية،

HDR: knockins and Precise Modifications

وعندما يلزم إدخال تعديل دقيق - مثل إدخال بطاقة فلوريسنت أو تحويل نقطة أو حليب مشروط - يستخدم تقرير التنمية البشرية، وتكون كفاءة استخدام الخلايا الخلوية غير المكتملة منخفضة عادة )١-١٠ في المائة( وتتطلب وضع نموذج للمانحين، ويمكن أن يكون المانح هولنديا مصمما على أساس واحد )الزنزانات ذات الصبغة الدرقية( لاختيار الثروات الصغيرة أو الفصيلة.

:: تسليم عناصر البرنامج إلى الخلايا الثقافية

ويتوقف نجاح تجربة " سيريسبار " اعتمادا كبيرا على كفاءة تسليم بروتين كاس 9 و " سي جينا " إلى النواة، وهناك عدة طرق متاحة، لكل منها مزايا وقيود، ويتوقف الاختيار على نوع الخلايا، والميزانية، والنواتج المرغوب فيها.

الإصابة

وتستخدم مادة الليبومات أجهزة لتشكيل مكوّنات مكوّنة من الدهون المكبوتة بلوسائل حمض نووي مثبتة بالبلازميد، وهي تعمل بشكل مباشر على خطوط سهلة الانتقال مثل هيلاك 293T وخطوط عديدة خلايا السرطان، غير أن الليبومات أقل كفاءة بالنسبة للزنزانات الأولية والخلايا الجذعية والخلايا المغلقة.

Electroporation

ويطبق التحلل الكهربائي على نحو مختصر من أجل موازنة الخلايا بشكل متبادل، مما يسمح بدخول الحمض النووي أو RNA أو مجمعات الشرطة الوطنية، كما أن النظم الحديثة مثل مفاعل لونزا أو نهر ثيرمو فيشر توفر كفاءة عالية حتى في الخلايا التي يصعب نقلها، بما في ذلك الخلايا الجذعية التي يسببها التكاثر (iPSCs) والخلايا الافتراضية (Terop).

ناقلات فيروسية

وبالنسبة للخلايا التي تشكل انتكاسة للتحول، فإن عملية التحويل الفيروسي توفر بديلاً موثوقاً به، ويمكن للموصلات الخفية أن تدمج بشكل ثابت قشور تعبير " كاس 9 " و " سي إن " ، مما يجعلها مثالية لشاشات " CRISPR " المجمعة، كما تستخدم ناقلات فيروس " Adeno-associated " في إيصال نماذج المانحين في تجارب نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج، وإن كانت قدرة محدودة على جمع العبوات().

الحقن الدقيق وطرق نانوب جزيئات

فالحقن الدقيق كثيف اليد العاملة، ولكنه يمكن أن يحقق الدقة في الخلايا الواحدة، وكثيرا ما يستخدم في تحرير الزغدة في إنتاج الحيوانات العابرة جينيا، وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير الجسيمات النانوية الشحيحة وجسيمات النانوب الذهبية من أجل تسليم الماس 9 مليراً من الروسينات الرجعية والزنوجات النيوزيائية، مما يوفر بديلاً غير فيروسي مع انخفاض درجة التجانس.

اختيار الخلايا المحررة وإثراءها وتثبيتها

وبعد الولادة، لن يكون هناك سوى مجموعة فرعية من الخلايا التي ستُجرى التحرير المنشود، ولا بد من استراتيجيات الإثراء للحصول على عدد نقي من السكان لإجراء التجارب في المجرى.

Fluorescent Reporters and FACS

ويشمل ذلك مراسلاً غير مرئي (مثلاً، GFP أو BFP) في قسيمة التحرير أو استخدامه لتوصيل مشترك لعلامة الفلورسنت المستقلة، ويتيح لمؤسسة FACS فرز الخلايا المعدلة بنجاح، أما بالنسبة للهايدرو دوغنز، فيمكن فرز الخلايا استناداً إلى تعبير عن البطاقة الفلورية، مما يتسارع إلى حد كبير في عزلة الجمبري.

Selection Antibiotics

وإذا تم إدخال جينات مقاومة من الجرو أو الفلفل أو النيوميسين، فإن اختيار المضادات الحيوية يمكن أن يثري بسرعة للخلايا المحررة، غير أن هذه الطريقة لا تميز بين الخلايا التي أدمجت جين المقاومة في مكان التعرّف المستهدف مقابل أحداث الاندماج العشوائي، ولذلك يلزم التحقق من ذلك.

التضليل والتقييم

ويجب أن يتم تصوير مستنسخات الترسبات المرادفة باستخدام جهاز PCR، أو تسلسل سانغر، أو تسلسل الجيل التالي، أما بالنسبة للمستنسخات التي تُستخدم في الدق، فيوصى بتركيب مزيج من التسلسل عبر الموقع المقطعي والضرب الغربي لخسارة البروتين، وبالنسبة للطرق، يمكن للجهاز PCR الذي يمتد ليشمل ذراعي الهومولوجيا أن يؤكد التكامل الصحيح، ويمكن أن يستبعد التسلسل الزاحف العصيان العصيان العصيان العصيان العصيان في الملصقات.

تطبيقات الخلايا المزودة بأجهزة تعديل في مجال البحوث

إن مجموعة الأسئلة التجريبية التي يمكن معالجتها باستخدام الخلايا التي يحررها برنامج البحوث المتعلقة بالإحصاءات المناخية واسعة النطاق، ونسلط الضوء على عدة مجالات رئيسية.

مؤسسة جينوميك

وتستخدم شاشات " CRISPR " المكتبات البلاستيكية التي تحتوي على آلاف من الناموسيات المغناطيسية لضرب كل جينات الجنين بصورة منهجية، وبعد اختيار نوع من أنواع الفيتامينات (مثل بقاء الخلايا تحت العلاج أو مقاومة الإصابة بفيروسات الفيروسات العكوسة)، تحدد التسلسل العميق للناموسيات المتكاملة الجينات الضرورية للعملية، وكان هذا النهج مفيدا في اكتشاف مواطن الضعف الجديدة للسرطان، وعوامل المسببة للممرضات.

:: وضع نماذج للأمراض مع خطوط الخلايا المسببة للإيسوجين

ومن خلال إدخال طفرة خاصة بالمرضى إلى خط خلايا التحكم، يخلق الباحثون نماذج مسببة للمرض تختلف فقط عن طفح الاهتمام، مما يزيل آثار الخلفية الوراثية، ومن أمثلة ذلك إدخال BRCA1 ] 185 من خلايا الإنقاذ المصوبة في MCF10A، يتيح دراسة دقيقة لكيفية تأثير هذا التحول على الحمض النووي والولادة.

التدخل في شؤون حقوق الأشخاص ذوي الإعاقة وتنشيطها (CRISPRi/a)

(د) الكاس 9 (د-كاز) المميتة حافزاً والمنبثقة عن مقاومي الوصف (مثلاً، KRAB) أو المنشطين (مثل VP64) يتيح تغيير تعبير الجينات دون قطع الحمض النووي، ويمكن أن يصمت مركز البحوث والبحوث الجنائية بكينات ذات خصوصية عالية، بينما يمكن أن يُحدث نظاماً للاختبارات المحلية.

تعقب الخط وربطه

وبإرسال مكتبة من تسلسلات الشوكودية الفريدة عن طريق البيوت المهددة إلى مكان آمن للمرفأ، يمكن للباحثين أن يتتبعوا الديناميات المستنسخة لسكان الخلايا على مر الزمن، وهذه التقنية، المعروفة باسم باركرينغ أو كارلين، تكشف عن كيفية مساهمة الخلايا الفردية في التفريق أو التخميد أو مقاومة المخدرات.

التحديات والخسائر التقنية

ورغم سلطتها، فإن تحرير البرنامج في مجال الثقافة الخلوية ليس بدون صعوبات، فالاعتراف بهذه التحديات والتخفيف منها أمران حاسمان لتحقيق نتائج قابلة للتكرار.

الآثار غير المستهدفة

يمكن للخسائر أن تتسامح مع الأخطاء في الجرعة المزروعة في نظام " دينا " ، مما يؤدي إلى إدخال مواد غير مقصودة في مكان آخر من الجينوم، ويمكن للطيور غير المستهدفة أن تخلط بين التحليلات والتجارب المضللة في أسفل المجرى.

انخفاض كفاءة استخدام حقوق الإنسان في التنمية

وكثيراً ما تكون عملية إعادة التأهيل البشرية غير فعالة، ولا سيما في الخلايا غير المقاصة أو التي تقسم ببطء، لأنها تتطلب نموذج المانحين وآلية إعادة التوحيد النشطة، ولتحسين عملية إعادة الإدماج، يمكن للباحثين أن يتزامنوا خلايا في مرحلة S، باستخدام المثبطات الكيميائية (مثلاً، نوكودازول)، واستخدام الجزيئات الصغيرة التي تُكبح النهضة (مثلاً، أو المتبرعات المعدلة بموجب المادة 7، أو الحمض النووي - الحمض النووي).

Mosaicism and Clonal Variability

وحتى بعد استنساخ الخلايا الوحيدة الخلايا، لا يجوز لجميع الخلايا في السكان أن تحمل نفس التحرير بسبب التعبير المطول عن الكاس 9 أو الإصلاح الجاري، وهذا أمر يثير إشكالية خاصة في الخلايا الجذعية، ويقلل التعبير عن الكاس9 إلى نبض قصير (يستخدم نسل الناتو أو النظم غير التعليمية) من السخرية، وبالإضافة إلى ذلك، يوصى بالتصديق الدقيق على عدة مستنسخات مستقلة لضمان الاتساق بين الغلاف الجوي.

السمية الخلوية وإجهاد التوصيل

ويمكن أن تؤدي عمليات التحول والكهرباء والتحول الفيروسي إلى استجابات للإجهاد الخلوي، بما في ذلك الإشارة إلى الضرر الذي يلحق بالحمض النووي والزئبق، واستخدام البروتوكولات المثلى، وتقليل كمية حمض النواة المسلمة إلى أدنى حد، والسماح بوقت كاف للتعافي من الأمراض الخلوية، وفي حالات الخلايا الحساسة مثل الخلايا العصبية الأولية أو الخلايا الجذعية الدموية، كثيرا ما يُفضَّل التسليم على أساس النترونية مع ظروف النوا.

الاعتبارات الأخلاقية والتنظيمية

وفي حين أن خلايا تحرير الثقافة الخاصة بالبحوث الأساسية تندرج في إطار المبادئ التوجيهية الموحدة المتعلقة بالسلامة البيولوجية والتحامل النووي المكرر، فإن عدة أبعاد أخلاقية تستحق الاهتمام، وعندما تستخدم البلدان التي تعمل بالشبكة الدولية للجراثيم أو الخلايا الجذعية الجنينية، قد يلزم المزيد من الرقابة من لجان الرقابة على البحوث في الخلايا الجذعية، ويجب أن يلتزم تحرير الخلايا الاصطناعية بالل الصارم للنظم المتعلقة بمكافحة والتصنيف.

الاتجاهات المستقبلية والتكنولوجيات الناشئة

ولا يزال مجال البحوث المتعلقة بالاختبارات المناخية يتطور بسرعة، كما أن ما يلي هو التطورات الرئيسية التي تعد بزيادة توسيع نطاق تحرير ثقافة الخلايا.

القاعدة

ويُستخدم محررو القاعدة في كاز 9 (النايز) المعطّل بشكل محفز إلى إنزيم ديميناس، مما يتيح تحويل زوج أساس مباشر إلى آخر (مثلاً، C ⁇ T أو A ⁇ G) دون اشتراط نموذج ثنائي الفينيل متعدد الأطراف أو نموذج المانحين، وهذه التكنولوجيا مثالية لتشكيل نقاط الطفرة وتصحيح النُهج المسببة للأمراض في خطوط الخلايا ذات الكفاءة العالية والحد الأدنى من النواتج العرضية.

Prime Editing

ويستخدم تحرير نظام تقييم الاحتياجات من الموارد البشرية (PgRNA) الذي يحمل الطبعة المطلوبة، ويمكنه إدخال الإضافات، والرسوبيات، وجميع عمليات التحويل المحتملة من القاعدة إلى القاعدة وعددها 12 عملية مع عدد قليل جدا من الدراجات غير المستهدفة، ومع أن التسليم في ثقافة الخلايا أكثر تعقيدا، فإن عملية الاعتماد من الناحية الجينية تتسم بسرعة.

In Vivo Editing and Organoid Models

ويتزايد عدد الدراسات التي تطبق نظام " CRISPR " مباشرة على الخلايا داخل الكائنات العضوية أو عن طريق حقن عناصر تحرير الحيوانات الحية، مثلا، فإن تسليم مكونات " CRISPR " عبر شبكة AAV إلى مركز التلقيم أو كبد نماذج الفئران يسمح بتصحيح العيوب الوراثية في الموقع .

Multiplexed Editing and Synthetic Biology

وباستخدام عدّة مبيدات للحشرات في آن واحد، يمكن للباحثين تحرير عدة جينات في آن واحد، مما يمكّن من بناء دوائر للجين الاصطناعي أو وضع نماذج للأمراض البوليجينيّة، كما يمكن استخدام نظم مثل الأشعة المميتة 7 (Cas12a) التي تُعالج صفيفة البوليسترين الاصطناعي وتبسّط التكليل، بالإضافة إلى ذلك، في إدماج مجموعات كبيرة من الجين الاصطناعي في برامج فتح الباب الآمن.

النظر في البروتوكول العملي

ولتنفيذ عملية تحرير نظام " سيريس " في ثقافة الخلايا، نوصي بتدفق العمل التالي:

1. Design 3-5 sgRNAs per target using validated prediction algorithms (]Doench et al., Nature Biotechnology, 2016).
2. Clone sgRNAs into an expression vector (e.g., lentiCRISPRv2) or purchase chemically modified sgRNAs.
3. Deliver Cas9 and sgRNA via the most appropriate method for your cell type (RNP electroporation for stem cells; plasmid lipofection for HEK293T).
4. السماح بتسعين ساعة و72 ساعة للتحرير، ثم جمع الحمض النووي الجيني، والقيام بمؤخرة من طراز T7E1 أو المسح لتقدير كفاءة التحرير.
5. خلايا محررة غنية تستخدم علامة اختيار مُثبَتة أو علامة حرف فاسد، ثم تُصنف الخلية الواحدة إلى 96 لوحة وَيْض.
6. Screen clones by PCR and Sanger sequencing, and pick at least two independent clones for phenotypic validation.
7. تأكد من تحرير المواقع التي تتجه نحو الجيل القادم وتفقدها

ويمكن الحصول على بروتوكولات مفصلة من مركز موارد المؤسسة (CRISPR) التابع للمؤسسة ((FLT:1]، الذي يقدم أدلة البلاستيك والبروتوكولات وكشف المشاكل، وفيما يتعلق بشاشات المخرجات العالية، يوفر منهاج عمل المعهد العام للتنقيب الوراثي ] مكتبات وأدوات تحليلية مصممة مسبقاً [FLT:]

خاتمة

وقد أصبحت تكنولوجيا البحوث المتعلقة بالعلم البشري أداة لا غنى عنها لتعديل الخلايا في الثقافة، وتمكين الباحثين من تطهير وظيفة الجينات، ونموذج الأمراض البشرية ذات الدقة غير المسبوقة، ووضع استراتيجيات علاجية جديدة، واختيار أساليب التنفيذ المناسبة، والتحقق الصارم من المستنسخات المحررة، يمكن للعلماء أن يستغلوا الإمكانات الكاملة للكشف عن المعلومات، مع استمرار أدوات جديدة مثل تعديل البصيرة الواعدة في مجال الطب.