Introducción a la ingeniería celular basada en el CRISPR

El advenimiento de la tecnología de repeticiones paletrómicas cortas interespaciales (CRISPR) agrupadas regularmente ha transformado fundamentalmente cómo los investigadores manipulan el genoma de las células cultivadas. Permitiendo ediciones precisas y programables en casi cualquier lugar en un genoma eucarístico, los sistemas CRISPR permiten a los científicos crear líneas celulares isógenas, realizar pantallas geómicas funcionales y construir modelos de enfermedad precisos en un plato.

Este artículo ofrece una visión general de la aplicación de CRISPR para modificar las células cultivadas. Cubrimos los componentes básicos de CRISPR-Cas9, protocolos detallados para la entrega y selección, estrategias avanzadas de edición, trampas comunes e innovaciones emergentes que están impulsando el campo hacia adelante. El objetivo es dar a los investigadores nuevos y experimentados una guía práctica, lista para la producción para utilizar CRISPR en sus flujos de trabajo de cultivo celular.

Componentes básicos de CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 consiste en dos moléculas esenciales: una endonucleasa Cas9 y una guía única RNA (sgRNA).El sgRNA contiene una secuencia de 20 núcleos que es complementaria a la región de ADN objetivo, seguido de un andamio que une a Cas9. Para cortar el ADN objetivo debe ser seguido inmediatamente por un corto protospacer motivo adyacente (PAMLT)

Los investigadores pueden diseñar sgRNAs usando herramientas como CHOPCHOP para maximizar la actividad en el objetivo y minimizar el potencial fuera del objetivo. El DSB se repara luego por una de dos vías endógenas: unión de extremos no homologados (NHEJ), que es propensa a errores e introduce pequeñas inserciones o plantillas de homología (indelfabricación de audio)

NHEJ: Knockouts and Indel Mutations

Para la mayoría de los estudios de pérdida de funciones, NHEJ es la ruta preferida. Al entregar Cas9 y un sgRNA apuntando a un exón de codificación, los investigadores generan una mezcla de indels que causan cambios de marco o codones de parada prematuros. Después de un período de recuperación, las células son clonadas de células individuales y secuenciadas para verificar el golpe.

HDR: Modificaciones de Knockins y Precisa

Cuando se requiere una modificación precisa, como insertar una etiqueta fluorescente, una mutación de puntos o un alelo condicional, se emplea HDR. La eficiencia HDR en las líneas celulares inmortalizadas es típicamente baja (1–10%) y requiere una co-entrega de una plantilla de donantes.El donante puede ser una oligonucleótido de una sola raya (ssODN) para pequeñas ediciones o un brazo de homología basado en plas.

Entrega de componentes de la RCP en células cultivadas

El éxito de un experimento CRISPR depende en gran medida de la entrega eficiente de la proteína Cas9 y el sgRNA en el núcleo. Hay varios métodos disponibles, cada uno con ventajas y limitaciones. La elección depende del tipo de célula, presupuesto y rendimiento deseado.

Lipofection

La lipofectión utiliza reactivos lípidos cationicos para formar complejos con codificación de ADN plasmido Cas9 y sgRNA. Es sencillo y funciona bien para líneas fáciles de transfectar como HEK293T, HeLa y muchas líneas de células cancerosas. Sin embargo, la lipofección es menos eficiente para células primarias, células madre y células de suspensión.

Electroporación

La electroporación aplica un breve pulso eléctrico para permeabilizar la membrana celular, permitiendo entrar en los complejos de ADN, ARN o RNP. Los sistemas modernos como el Nucleofector Lonza o el Neón de Thermo Fisher ofrecen una alta eficiencia incluso en las células difíciles de transfectar, incluyendo las células madre pluripotente inducidas (iPSCs) y las células Tmid.

Vectores Virales

Para las células que son refractarias a la transfección, la transducción viral proporciona una alternativa confiable. Los vectores de Lentiviral pueden integrarse considerablemente los cassettes de expresión Cas9 y sgRNA, haciéndolos ideales para las pantallas de CRISPR combinadas. Los vectores de virus asociado (AAV) también se utilizan para la entrega de plantillas de donantes en los experimentos de HDR, aunque su capacidad de embalaje es limitada (~4.5 kb).

Métodos basados en la microinyección y la nanopartícula

La microinyección es de gran densidad de mano de obra, pero puede alcanzar precisión de una célula, a menudo utilizada para la edición de zygote en la producción de animales transgénicos. Más recientemente, nanopartículas lípidos y nanopartículas de oro se han desarrollado para la entrega transitoria de Cas9 mRNA y sgRNA, ofreciendo una alternativa no viral con menor inmunogenia.

Selección, Enriquecimiento y Validación de las Células Editadas

Después de la entrega, sólo un subconjunto de células llevará la edición deseada. Las estrategias de enriquecimiento son esenciales para obtener una población pura para experimentos de aguas abajo.

Reporteros fluorescentes y FACS

Incluyendo un reportero fluorescente (por ejemplo, GFP o BFP) en la caseta de edición o usando co-entrega de un marcador fluorescente separado permite que FACS ordene aislar células modificadas con éxito. Para los golpes HDR, las células pueden ser clasificadas en función de la expresión de la etiqueta fluorescente, acelerando enormemente el aislamiento clonal.

Antibióticos de selección

Si se introduce un gen de resistencia a la glomicidina, blasticidina o neomicina, la selección de antibióticos puede enriquecerse rápidamente para las células editadas. Sin embargo, este método no distingue entre las células que integran el gen de resistencia en el locus objetivo contra los eventos de integración aleatoria, por lo que se necesita una validación adicional.

Genotipado y validación

Los clones de Candidato deben ser genotipados usando PCR, secuenciación Sanger o secuenciación de próxima generación. Para los clones de knockout, se recomienda una combinación de secuenciación en el sitio de corte y la mancha occidental para la pérdida de proteínas. Para los tobillos, PCR de largo alcance que abarca ambos brazos de homología puede confirmar la integración correcta, y secuenciación de la unión puede descartar indels en las junctions.

Aplicaciones de Células modificadas por el CRISPR en investigación

La gama de preguntas experimentales que se pueden abordar utilizando células con punta CRISPR es vasta. A continuación destacamos varias áreas clave.

Pantallas Genomic funcionales

Las pantallas de CRISPR agrupadas utilizan bibliotecas entivirales que contienen miles de SgRNAs para eliminar sistemáticamente cada gen del genoma. Después de la selección para un fenotipo (por ejemplo, supervivencia celular bajo tratamiento de drogas o resistencia a la infección viral), la secuencia profunda de los SgRNAs integrados identifica genes que son esenciales para el proceso. Este enfoque ha sido instrumental para descubrir nuevas vulnerabilidades de cáncer, factores anfitriones para las respuestas inmunológicas y reguladoras.

Modelo de enfermedad con líneas de células escogénicas

Al introducir mutaciones específicas de los pacientes en una línea de células de control, los investigadores crean modelos isógenos que difieren solamente en la mutación de interés. Esto elimina los efectos de fondo genético confusos. Por ejemplo, la introducción de BRCA1] 185delAG mutación en las células epiteliales de mama MCF10A permite un estudio preciso de cómo esa alteración afecta a los pacientes de gran alcance de la reparación de ADN y la plataforma de tumorigenesis.

Interferencia y activación del CRISPR (CRISPRi/a)

Cas9 (dCas9), con efecto catálico, se fusionan con los represores transcripcionales (por ejemplo, KRAB) o los activadores (por ejemplo, VP64) permiten la modulación de la expresión genética sin cortar el ADN. CRISPRi puede silenciar genes con alta especificidad, mientras que CRISPRa puede aumentar los genes endógenos. Estas herramientas son especialmente útiles para estudiar genes esenciales que no pueden ser eliminados o para la pantalla.

Tracing y Barcoding de linaje

Mediante la entrega de una biblioteca de secuencias de códigos de barras únicas a través de HDR en un locus seguro portuario, los investigadores pueden rastrear la dinámica clonal de las poblaciones celulares con el tiempo. Esta técnica, conocida como códigos de barras CRISPR o CARLIN, revela cómo las células individuales contribuyen a la diferenciación, metástasis o resistencia a las drogas.

Desafíos y saltos técnicos

A pesar de su poder, la edición de CRISPR en la cultura celular no es sin dificultades. Reconocer y mitigar estos desafíos es fundamental para obtener resultados reproducibles.

Efectos fuera de la toma

Cas9 puede tolerar desdibujos en el dúplex sgRNA:DNA, lo que lleva a ediciones no deseadas en otras partes del genoma. Las mutaciones fuera de objetivo pueden confundir el análisis fenotípico y los experimentos de flujo inverso. Las estrategias para minimizar los efectos fuera de objetivo incluyen el uso de las variantes Cas9 de alta fidelidad (por ejemplo, puntuaciones experimentales de p. eSp.

Eficiencia de baja HDR

HDR es a menudo ineficiente, especialmente en células no divididas o que se dividen lentamente, porque requiere la plantilla de donante y la maquinaria de recombinación homologosa activa. Para mejorar la HDR, los investigadores pueden sincronizar las células en la fase S usando inhibidores químicos (por ejemplo, nocodazol), utilizar pequeñas moléculas que suprimen NHEJ (por ejemplo, SCR7 o plantillas de ADN-PKro)

Mosaicismo y variabilidad Clonal

Incluso después de la clonación de células individuales, no todas las células de una población pueden llevar la misma edición debido a la expresión prolongada de Cas9 o la reparación continua. Esto es particularmente problemático en las células madre. Limitar la expresión Cas9 a un pulso corto (utilizando sistemas RNP) reduce el mosaicismo. Además, se recomienda una validación cuidadosa de múltiples clones independientes para asegurar la consistencia fenotípica.

Estrés de Toxicidad Celular y Entrega

La transfección, electroporación y transducción viral pueden desencadenar respuestas de estrés celular, incluyendo señalización de daño al ADN y apoptosis. Utilizando protocolos optimizados, minimizando la cantidad de ácido nucleico entregado, y permitiendo un tiempo de recuperación adecuado puede mejorar la salud celular. Para tipos de células sensibles como neuronas primarias o células madre hematopoyéticas, la entrega basada en RNP con condiciones de electroporación suaves suele ser preferida.

Consideraciones éticas y reglamentarias

Mientras que la edición de células en la cultura para la investigación básica se encuentra bajo las directrices institucionales estándar de bioseguridad y ADN recombinantes, varias dimensiones éticas merecen atención. Cuando se utilizan iPSCs humanos o células madre embrionarias, se puede exigir supervisión adicional de comités de supervisión de células madre. La edición de células somáticas para aplicaciones terapéuticas potenciales debe cumplir con estrictas regulaciones de FDA y EMA.

Future Directions and Emerging Technologies

El campo CRISPR sigue evolucionando rápidamente. A continuación se presentan los principales acontecimientos que prometen ampliar aún más el alcance de la edición de la cultura celular.

Edición de la base

Los editores de base fusionan una Cas9 (nickase) catalíticamente con una enzima deaminasa, permitiendo la conversión directa de una base par a otra (p. ej., C→T o A→G) sin requerir una plantilla de DSB o de donantes. Esta tecnología es ideal para modelar mutaciones de puntos y corregir SNPs patógenos en líneas celulares con alta eficiencia y subproductos de indel mínimo.

Edición de Prime

La edición primera utiliza un nickase Cas9 fusionado con un transcriptasa inversa, junto con una guía de edición principal RNA (pegRNA) que lleva la edición deseada. Puede introducir inserciones, borraciones y las 12 posibles conversiones base a base con muy pocas ediciones fuera de objetivo. Aunque la entrega en la cultura celular es más compleja, la edición de primera es rápidamente ganando adopción para una modificación genética precisa.

En Vivo Editar y Organizar Modelos

Cada vez más estudios están aplicando CRISPR directamente a células dentro de organoids o inyectando componentes de edición en animales vivos. Por ejemplo, la entrega de componentes CRISPR a través de AAV en la retina o hígado de modelos de ratón permite corregir defectos genéticos in situ. Combinar CRISPR con sistemas de cultivo de organoides 3D proporciona una plataforma de desarrollo aún más fisiológica y relevante.

Edición múltiple y biología sintética

Utilizando múltiples SgRNAs simultáneamente, los investigadores pueden editar varios genes de inmediato, permitiendo la construcción de circuitos de genes sintéticos o el modelado de enfermedades poligénicas. Sistemas como el MAD7 (Cas12a) nuclease, que procesa su propia matriz CRISPR, simplificando la multiplexación. Además, CRISPR puede ser utilizado para integrar grandes cúmulos de genes sintéticos en loci seguro puerto, abiendo la puerta a la programación de la conducta celular para la biomanufactura.

Consideraciones relativas al Protocolo

Para implementar la edición de CRISPR en la cultura celular, recomendamos el siguiente flujo de trabajo:

  1. Diseño 3-5 sgRNAs por objetivo utilizando algoritmos de predicción validados (Doench et al., Nature Biotechnology, 2016).
  2. Los sgRNAs de clonación en un vector de expresión (por ejemplo, lentiCRISPRv2) o compran SgRNAs sintéticos modificados químicamente.
  3. Entregar Cas9 y sgRNA a través del método más adecuado para su tipo de célula (exiporación RNP para células madre; lipofectión plasmida para HEK293T).
  4. Permitir 48–72 horas para la edición, luego cosechar ADN genómico y realizar un ensayo T7E1 o Surveyor para estimar la eficiencia de edición.
  5. Enrich edited cells using a co-expressed selection marker or FACS, then single-cell sort into 96-well plates.
  6. clones de pantalla por PCR y secuenciación Sanger, y elegir por lo menos dos clones independientes para validación fenotípica.
  7. Confirme la edición en el objetivo y verifique los sitios de arriba fuera del objetivo por secuenciación de próxima generación.

Los protocolos detallados están disponibles en Centro de recursos CRISPR de Addgene], que ofrece guías de plasmidos, protocolos y solución de problemas. Para pantallas de alto rendimiento, la Plataforma de Perturbación Genética del Instituto Ancha proporciona bibliotecas y herramientas de análisis de SgRNA previamente diseñadas.

Conclusión

La tecnología CRISPR se ha convertido en una herramienta indispensable para modificar las células de la cultura, permitiendo a los investigadores diseccionar la función genética, modelar las enfermedades humanas con precisión sin precedentes, y desarrollar estrategias terapéuticas nuevas. Al diseñar cuidadosamente las SgRNAs, seleccionar métodos de entrega adecuados y validar rigurosamente clones editados, los científicos pueden aprovechar el potencial completo de la CRISPR para avanzar en el descubrimiento.