Cómo utilizar técnicas de flujo desechado para medir la reacción rápida Kinetics

El reto de medir las reacciones rápidas

Muchos de los procesos químicos y biológicos más importantes se producen en escalas de tiempo de milisegundos, microsegundos, o incluso más rápido. Catálisis de enzimas, plegado de proteínas, ligando unión y transferencia de electrones se despliegan en el enlace de un ojo. Métodos cinéticos tradicionales, que dependen de mezcla manual o muestreo de lotes, no pueden resolver eventos que suceden más rápido que un segundo método de mezclar

¿Cuál es la Técnica de Altos Flujos?

La técnica de flujo detenido es un método para iniciar y observar reacciones químicas o bioquímicas rápidas bajo condiciones controladas. En su forma más simple, dos o más soluciones reaccionarias son impulsadas de jeringas separadas en una cámara de mezcla, donde se reúnen y se mezclan a fondo en una fracción de un milisegundo. La solución mixta luego fluye en una célula de observación, a menudo una pequeña cuvette, y el flujo es abruptamente detenido por una válvula de suspensión de la

Originalmente desarrollado en los años 40 y refinado en las décadas posteriores, la instrumentación de flujo de parada ha evolucionado desde sistemas voluminosos y operados manualmente hasta dispositivos controlados por ordenador, altamente sensibles capaces de detección de longitudes múltiples. Los instrumentos modernos suelen alcanzar tiempos de muerte (el tiempo entre mezclar y el inicio de la adquisición de datos) de uno a dos milisegundos, y las versiones microfluídicas especializadas pueden empujar este límite por debajo de 100 micros segundos.

¿Cómo funciona el paro?

El ciclo de funcionamiento básico de un instrumento de flujo detenido puede dividirse en varias fases distintas:

Cargando: Las soluciones de reacción se colocan en dos o más jeringas de la unidad. Estas jeringas suelen estar termostacadas para mantener una temperatura constante.
Conducción: Un sistema neumático o mecánico empuja los impulsores de jeringa hacia adelante simultáneamente, forzando a los reaccionarios a través de tubos de alta velocidad en una pequeña cámara de mezcla. La unidad es generalmente rápida y reproducible, asegurando tasas de flujo consistentes.
Mixing: En el interior de la cámara de mezcla, los flujos de reaccionarios se mezclan turbulentamente. Las geometrías de mezcla común incluyen T-jets, diseños tangenciales de cuatro chorros y mezcladores de bolas, cada uno optimizado para lograr mezclar completa dentro de 100-500 microsegundos.
]Flow into the observation cell: La solución mixta pasa por la célula de observación, una cuvette de pequeño volumen con ventanas ópticas. El volumen de la célula es típicamente una fracción de un mililitro.
Parar y adquirir datos:] Cuando la mezcla llena la célula de observación y cualquier volumen de corriente, eventualmente empuja contra una jeringa de parada. Cuando la jeringa de parada alcanza un límite de preestablecido, un interruptor desencadena dos eventos: el flujo se detiene y comienza la grabación de datos. Debido a que la parada ocurre esencialmente instantáneamente, la mezcla de reacción está ahora recolectando kinetic, y el detector comienza.
Repetir y repetir: Después de la recogida de datos, la célula de observación y la cámara de mezcla se funden con amortiguación o la siguiente muestra, y el ciclo repite para las mediciones de replicación o diferentes condiciones.

Componentes clave de un instrumento de alto flujo

Comprender el papel de cada componente ayuda a apreciar el poder y las limitaciones de la técnica.

Gestidos y actuadores: La unidad debe proporcionar una velocidad de flujo constante y reproducible. Los pistones neumáticos son comunes; los motores de paso se utilizan en sistemas que requieren un control preciso de volumen.
Cámara de mezcla: La eficiencia de mezcla determina el tiempo muerto. Los mezcladores de alta calidad utilizan flujo turbulento en canales pequeños para lograr una homogeneidad rápida. Los tiempos muertos se miden a menudo observando la reacción de un estándar (por ejemplo, reducción de 2,6-dicclorofenoldofenol por ácido ascórbico).
] Celular de observación: Típicamente una cubeta de cuarzo con una longitud de 1-10 mm, diseñada para un acceso óptico rápido. Para mediciones de fluorescencia, la célula puede haber pulido ventanas en ángulos rectos.
] Sistema de detección: Los tubos fotomultiplelier (PMT) o los arrays de fotodiode se utilizan para monitorear la intensidad de la luz. Un monocromador o filtro selecciona la longitud de onda adecuada. Los instrumentos modernos pueden grabar simultáneamente múltiples longitudes de onda mediante matriz de diodos o dispositivos de cocción de carga (CCDs).
Dejar de pulsar y desencadenar: La jeringa de parada proporciona una presión trasera definida y actúa como un disparador mecánico. Un sensor óptico o eléctrico detecta el alto y comienza la adquisición de datos con un retraso mínimo.
Control de temperatura: La trayectoria de fluidos entera —síringas, mezcladoras y celulares— se suele encerrar en un bloque de agua conectado a un baño circulante para mantener una temperatura constante (a menudo de 20 a 25 °C, pero puede ser variada).
Sistema de adquisición de datos: Los convertidores analógicos a digital de alta velocidad muestran la señal del detector a velocidades de kilohertz a megahercios, capturando cientos o miles de puntos de datos por segundo.

Medición de la reacción rápida Kinetics con Stopped-Flow

Tasa de Extracción Constantes de Datos Transientes

[LT] [FLT] [FLT]] [La concentración de FLT] [FLT]] [FLT]]]

Los mecanismos más complejos, como la unión de dos pasos o la catalisis de enzimas (Kinetica Michaelis-Menten), requieren el ajuste global de múltiples trazas recolectadas en diferentes condiciones. Los paquetes de software (por ejemplo, KinTek, Biologic o herramientas de código abierto como QtiPlot) se utilizan para adaptarse a las ecuaciones de tarifas integradas derivadas del mecanismo propuesto.

Un parámetro importante en los experimentos de flujo detenido es el tiempo muerto]. Las reacciones que son más rápidas que el tiempo muerto ya habrá progresado antes de que se registre el primer punto de datos. Esto significa que la amplitud de la fase rápida puede ser subestimada, lo que puede conducir a errores en el análisis cinético. El tiempo muerto se mide rutinariamente utilizando una reacción rápida conocida y es especificado por el fabricante.

Métodos de detección

La elección del método de detección depende de la reacción que se está estudiando:

]Apropiación visible UV: Adecuado para reacciones que implican cambios en las concentraciones de cromoforo, por ejemplo, sustituyen la rotación de las enzimas o ligando con cambios de absorción.
Fluorescencia: Mucho más sensible que la absorción, ideal para concentraciones bajas y para reacciones que implican fluoróforos intrínsecos o extrínsecos (por ejemplo, triptófanos en proteínas, etiquetas de dansilo).
Dicroismo coricular (CD) y dispersión rotatoria óptica (ORD):] Se utiliza para seguir cambios en la estructura secundaria, como el plegamiento de proteínas o el desplegamiento.
Difusión de la luz: Útil para monitorear las reacciones de agregación o polimerización.
Detección electrotecroquímica: Menos común pero posible con células especializadas que incluyen electrodos.

Ventajas y limitaciones de la caída de flujo

Ventajas

Resolución temporal: Los tiempos de muerte de 1–2 ms permiten observar procesos rápidos que no pueden seguirse mediante mezcla manual.
Monitoreo de tiempo real: Los trazos continuos proporcionan perfiles cinéticos completos, no sólo mediciones de punto final.
Consumo mínimo de muestra: Los volúmenes totales típicos por experimento son de 50–200 μL, y se pueden realizar múltiples repeticiones con pequeñas cantidades totales.
Versatilidad: Compatible con una amplia gama de modos de detección y tipos de muestras: absoluciones, suspensiones e incluso algunas preparaciones de membrana.
Control de temperatura: Todo el sistema puede ser termostatado, permitiendo estudios de dependencia de temperatura y análisis de arrienio.

Limitaciones

Límite de tiempo muerto: Las reacciones más rápidas que ~1 ms no pueden resolverse completamente; la explosión inicial se pierde. Para los kinetics de segundo ciclo, se necesitan otras técnicas como fotolisis flash o métodos de flujo continuo.
]Edipos de mezcla: La mezcla incompleta o no reproductible puede llevar a distorsiones de base o señales espurias. La calibración y elección de la geometría de mezcla son esenciales.
Edipos ópticos: Los cambios en el índice refractivo al mezclar pueden provocar saltos de base, especialmente al mezclar soluciones de diferentes composiciones.
Efectos inducidos por el flujo: Las fuerzas de alta vaina durante la mezcla pueden perturbar algunas delicadas asambleas macromoleculares, aunque raramente es un problema para la mayoría de las proteínas y enzimas pequeñas.
] Limitado a la fase de solución: El flujo de desperdicio está diseñado principalmente para muestras líquidas; muestras de estado sólido o muy viscosas son difíciles.

Aplicaciones de Stopped-Flow Across Science

Kinetics y Mecanismo Enzyme

La espectroscopia de flujo desechado es una piedra angular de la enzimología mecanista. Al mezclar una enzima con su substrato y monitoreo de la formación de productos o la absorción de cofactores, los investigadores pueden determinar las constantes de tasa pre-estado que revelan pasos individuales en el ciclo catalítico.Por ejemplo, la ruptura de la formación de productos en los primeros pocos milisegundos de una reacción puede indicar un paso de liberación de tasa-limitación de eficiencia de inhibido

Proteínas plegándose y desplegándose

El estudio de la dinámica de plegado de proteínas exige la iniciación rápida de la reacción plegable. En un experimento plegable típico de flujo detenido, una solución de proteínas desplegadas (por ejemplo, en alta concentración denatura) se mezcla rápidamente con un gran exceso de amortiguación que falta denatura, causando el rebote.

Ligand Binding y Drug Discovery

La medición de las tasas de asociación y disociación de fármacos o ligandos naturales de sus objetivos es crítica en la farmacología. La fluorescencia de flujo desminado puede resolver eventos vinculantes que ocurren en sub-segundos plazos. La técnica ayuda a determinar si la unión sigue un mecanismo bimolecular simple o implica un paso de cambio conformacional (inducido) tal información guía el diseño de medicamentos con optimizado en-y-extretro.

Reacciones químicas rápidas

En la química inorgánica y organometállica, el flujo de parada se utiliza para estudiar transferencia de electrones, sustitución de ligando y ciclos catalíticos. Por ejemplo, la cinética de la unión de oxígeno a los complejos de metales de transición es a menudo demasiado rápido para los métodos convencionales. Al mezclar un complejo metálico reducido con una solución de hidrógeno saturada en el flujo de parada, la formación de intermediarios metal-oxo puede ser monitoreado temprano.

Cambios Conformacionales en Macromolecules Biológicas

Más allá del plegado de proteínas, muchas funciones biológicas implican transiciones conformacionales desencadenadas por ligando, cambio de pH o salto de temperatura. El flujo de desperdicio combinado con dicroismo circular o FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) puede resolver estos movimientos. La aplicabilidad del flujo de parada a RNA y el plegamiento de ADN también se ha demostrado, especialmente para riboswitches y ribozymes.

Avances recientes en tecnología de alto flujo

Microfluídicos parado-Flow

La integración de los principios de flujo detenido en microfluídicos chips ha empujado tiempos muertos por debajo de 100 μs. En dispositivos microfluídicos, la mezcla laminar se mejora mediante advección caótica utilizando geometrías especializadas de canales. Estos sistemas consumen incluso volúmenes de muestras más bajos (nóleos) y pueden ser diseñados para la detección de alta velocidad.

Alto presurado de alto flujo

Para estudiar el efecto de la presión sobre las tasas de reacción y los volúmenes de activación, se han adaptado instrumentos de flujo parado para operar bajo altas presiones hidrostáticas (hasta varios cientos de MPa). Estos sistemas son inestimables para comprender la estabilidad de las proteínas y los mecanismos de reacciones enzimáticas bajo condiciones extremas que se encuentran en entornos de aguas profundas o reactores industriales.

Cryo-Stopped-Flow

El flujo de temperatura de sub-cero (a menudo llamado flujo de crio-stopped) permite a los investigadores disminuir las reacciones rápidas lo suficiente para detectar intermediarios fugaces. Mediante el uso de criosolventes (por ejemplo, mezclas de agua con sulfóxido de dimetil o metanol) y el funcionamiento a temperaturas tan bajas como −40 °C, las tasas de muchas reacciones químicas se reducen por órdenes de magnitud.

Comparación con otras técnicas de cinética rápida

El flujo de desperdicio es uno de varios métodos para estudiar reacciones rápidas; cada uno tiene sus propias fortalezas y limitaciones:

flujo continuo: Los reaccionarios fluyen a través de un tubo largo y los datos se miden a diferentes posiciones a lo largo del tubo, correspondientes a diferentes tiempos después de mezclar. El flujo continuo ofrece tiempos de muerte muy cortos (microseconds) pero consume grandes volúmenes de muestra. En contraste, el flujo de parada utiliza menos muestra y es más sencillo de implementar.
Flash photolysis / fotolisis láser: Usa un breve pulso láser para desencadenar una reacción (por ejemplo, disociación de un compuesto en jaula). Proporciona una resolución de tiempo exquisita (picosegundos) pero requiere un disparador fotolabil. El flujo de espera es más general para cualquier reacción que pueda iniciarse mezclando.
] El salto de temperatura (T-jump): Un rápido aumento de temperatura inducida por láser o descarga (casi grados en nanosegundos) relaja el equilibrio, y se monitorea el regreso al equilibrio. El timbre es excelente para estudiar cambios de conformación rápida pero limitado a sistemas con una fuerte dependencia de temperatura del equilibrio. El estudio de flujo de espera es más flexible.
]Arraigo anclado: Después de mezclar y de un retraso definido, la reacción se apaga mediante la adición de un reactivo duro (por ejemplo, ácido) y los productos se analizan fuera de línea. El flujo anclado puede acceder a puntos de tiempo muy tempranos, pero no proporciona datos continuos en tiempo real; el flujo de parada sí.

Consideraciones prácticas para configurar un experimento de alto flujo

Obtener datos cinéticos fiables de un instrumento de flujo detenido requiere una atención cuidadosa al diseño experimental:

Choice of buffer and ionic strength: Las soluciones deben ser filtradas y desgarradas para evitar burbujas de aire que pueden causar artefactos. Las diferencias de viscosidad entre los reaccionantes deben minimizarse para asegurar una buena mezcla.
Determinación del tiempo muerto: Siempre mide el tiempo muerto de su instrumento bajo las mismas condiciones de flujo que su experimento utilizando una reacción estándar (por ejemplo, reacción entre DCPIP y ascorbate). Ajuste su ajuste de datos para excluir puntos antes del tiempo muerto.
Experimentos de control: Ejecuta un control "sólo de flujo" (sembrando la misma solución con sí mismo) para comprobar la estabilidad de referencia. Además, compruebe que la reacción no se limita al mezclar artefactos comparando resultados a diferentes velocidades de flujo.
]Promedio de datos: Típicamente, se promedian 5–10 réplicas para mejorar la señal-al-ruido. Sin embargo, asegúrese de que la reacción es reproducible y que no se produzca una fotoblema o degradación de muestras durante experimentos repetidos.
Control de temperatura: Mantener una temperatura estable en todas partes. Para reacciones sensibles a la temperatura, incluso una deriva de 1 °C puede alterar las constantes de velocidad significativamente.

Conclusión

Las técnicas de flujo desechado han revolucionado el estudio de la kinetica de reacción rápida, permitiendo a los investigadores observar procesos que una vez se ocultan más allá de la barrera millisecond. Desde los conocimientos fundamentales en los mecanismos de enzimas y la proteína plegándose a aplicaciones prácticas en el descubrimiento de drogas y la ciencia de materiales, el flujo desperdicio sigue siendo una herramienta indispensable en el arsenal de la bioquímica y el avance de la acción.

Para más información sobre los fundamentos de la kinetica parada, vea el texto clásico de Fersht Estructura y Mecanismo en la Ciencia Proteína, o el artículo de revisión "Extroscopia de Fluores de Flujo endosado" en Cuentas de Investigación Química.