Mantener la esterilidad en los laboratorios de cultura celular es fundamental para la reproducibilidad y validez de los resultados experimentales. Los eventos de contaminación, ya sean bacterianos, fungos, micoplasmales o multicelulares, pueden invalidar semanas o meses de trabajo, desperdiciar reactivos costosos y comprometer la integridad de los datos.Una tasa de contaminación de hasta 5-10% puede reducir los resultados de la ciencia basada en la evidencia.

Fuentes de Contaminación en la Cultura Celular

Comprender dónde se originan los contaminantes es el primer paso hacia la prevención. Las fuentes primarias se clasifican en varias categorías:

Personal

Los humanos son el vector más común de contaminación. Los copos de piel, las gotas respiratorias y el cabello desmenuzado pueden llevar bacterias y hongos en el área de trabajo. Incluso un solo toque de mano sin guantes en una tapa de vasos de cultivo puede introducir Staphylococcus o [Limpieza de microorganismo]]

Medio ambiente y calidad del aire

El aire de laboratorio contiene partículas suspendidas, incluyendo esporas microbianas. El trabajo de cultivo celular debe realizarse dentro de un certificado Clase II Biosafety Cabinet (BSC) que proporciona aire lleno de HEPA. Sin embargo, incluso un BSC puede ser comprometido si el manejo del aire de la habitación es inadecuado o si el gabinete se coloca cerca de puertas, ventos, o de otros riesgos ambientales.

Suministros y Reagentes

Los medios de cultivo, sera, tripasina y antibióticos pueden contaminarse durante la fabricación, almacenamiento o manipulación. Aunque los medios comerciales están llenos de esteril, almacenamiento impropio, como dejar botellas sin explotar o utilizarlas en caducidad pasada, puede permitir el crecimiento microbiano. Las esporas de nivel pulmonar en el suero son una causa notoria de pérdida de cultivo.

Celdas de líneas de metro

La contaminación también se puede introducir con la línea celular. Mycoplasma es el contaminante más insidioso porque no produce turbididad visible o cambio de pH. Estudios estiman que 15–35% de las culturas celulares en uso común son micoplasma-positivas, a menudo sin el conocimiento del investigador.

"La contaminación por micoplasma puede alterar prácticamente todos los parámetros celulares estudiados, incluyendo la expresión genética, el metabolismo y la respuesta a los fármacos. Pruebas de cada línea celular entrante y de forma rutinaria después es esencial." — Guía de la Cultura de la Célula de Corning

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Prácticas básicas para mantener la esterilidad

Trabajo en un gabinete certificado de seguridad biológica (BSC)

El BSC es el equipo más importante para la cultura de células estériles. Proporciona un flujo de aire unidireccional, lleno de HEPA que protege tanto al operador como a las culturas. Para el trabajo de la cultura celular, un Clase II, tipo A2 gabinete es estándar.

  • Certificación y mantenimiento: Tener certificado el BSC anualmente (o más a menudo) por un técnico calificado. Verifique la alarma de flujo de aire y la integridad del filtro HEPA.
  • Uso adecuado: Mantener la correa en la altura correcta. Evite bloquear las parrillas delanteras o traseras. Colocar todos los elementos dentro del armario antes de comenzar el trabajo, una vez que se establece el flujo de aire, evitar movimientos rápidos de brazos que pueden interrumpir el campo estéril.
  • Carga y descarga: Desinfecta todos los artículos (botellas media, puntas de pipeta, frascos) con 70% de etanol antes de colocarlos en el BSC. Organizar materiales para que las áreas limpias (botellas media) estén separadas de los residuos (pipastas usadas).
  • ]Luz intravioleta: Muchos armarios tienen una luz UV para la descontaminación entre usos. Úsala por lo menos 15 minutos después del trabajo, pero note que la UV no es un sustituto de la desinfección superficial con etanol.

Higiene de mano y equipo de protección personal

Incluso con una BSC, las manos del operador son una fuente de contaminación primaria. Las manos de la correa minuciosamente con un jabón antimicrobiano antes de entrar en el área de la cultura celular. Usen nitrilo libre de polvo o guantes de látex que se ajusten bien. Después de donar guantes, rocíenlos con un 70% de etanol y permitan que secarse; repitan periódicamente.

  • Cambios de los grandes:] Cambiar los guantes inmediatamente si tocan algo no estéril, el exterior de una botella de medios, el reposabrazos de una silla, un pomo de la puerta o tu cara.
  • Lab coats: Usar un abrigo de laboratorio dedicado que se utiliza sólo en la suite de cultivo celular. Las fundas de mangas desechables pueden añadir una barrera adicional.
  • máscaras y fundas de pelo: Una máscara quirúrgica reduce el cobertizo de gotas, y una capucha de capucha o capucha evita que el pelo suelto caiga en las culturas. Para el trabajo de alta consequencia (por ejemplo, células primarias o células para uso clínico), un escudo de cara completa puede ser apropiado.

Equipos y suministros de esterilización

Cada artículo que entra en contacto con culturas o medios debe ser estéril. Esto incluye pipetas, puntas de pipeta (con filtros), frascos, tubos centrífugos y crioviales. Úsalo sólo estéril alternativo] plásticos desechables; evite reutilizar artículos de uso único. Para reutilizables vasos de vapor, como mínimo biberones de medios

  • Medios y suplementos: Esterilizar componentes sensibles al calor (por ejemplo, antibióticos, vitaminas, factores de crecimiento) mediante la filtración a través de un filtro de 0.22-μm. Los medios pre-encausados deben ser utilizados inmediatamente y no dejar a 37°C durante largos períodos.
  • ] Agua: Para la cultura celular, use sólo agua o agua de grado USP que se ha deionizado y luego está contaminada por estéril. Evite el agua destilada de las quietudes metálicas, que puede introducir endotoxinas.
  • ] Gestión de incubadoras: Incubadoras limpias regularmente, repisas y cacerolas de agua con desinfectante (por ejemplo, 70% de etanol o compuesto de anmonio cuadrienal). Use agua estéril y libre de cobre en la cacerola de humedad para inhibir el crecimiento bacteriano.

Minimizar los buques de cultura abierta

Cada momento que un vaso de cultivo está abierto, es vulnerable. Planifica tu flujo de trabajo para que puedas realizar todas las manipulaciones de forma rápida y eficiente. Usa técnica aséptica: sujetar gorros de manera estéril (no ponerlos en la superficie BSC), cuellos de llama de botellas de vidrio (si utilizas vidrio), y utilizar un movimiento rápido y suave al abrir y cerrar fras.

  • Trabajando en lotes: Cuando se procesan múltiples culturas, estrangular su trabajo para que nunca se esté haciendo la jugada simultánea de varios frascos abiertos.
  • Pipetting:] Usa una pipeta estéril separada para cada transferencia líquida. Nunca desplace la misma pipeta en una cultura y luego vuelva a una media.
  • Uso de antibióticos: Mientras que la penicilina-streptomicina o gentamicina pueden suprimir algunos contaminantes bacterianos, no matan micoplasma o hongos. La dependencia excesiva de antibióticos también puede ocultar la contaminación de bajo nivel. La mejor práctica es trabajar sin antibióticos para la cultura de rutina y depender puramente de la técnica estéril.

Superficies de trabajo desinfectados y equipos

Antes y después de cada sesión de trabajo, limpiar todas las superficies dentro del BSC con un desinfectante. 70% etanol es la opción más común porque se evapora rápidamente y es eficaz contra muchas bacterias y virus. Sin embargo, no mata a todos los organismos de formación de esporas; para una descontaminación más profunda, girar con un residuo esporicónico .

  • Limpieza suavemente profunda: Al menos una vez por semana, retire todos los elementos del BSC y limpie el interior a fondo con un limpiador esporicidal, luego con un 70% de etanol. Deje que el gabinete corra por lo menos 10 minutos después para purgar cualquier vapor.
  • Fuera de la BSC:] Desinfectar las tapas de banco, las manijas de incubación, los ojos del microscopio y los teclados de ordenador regularmente. Estas superficies de tacto alto son frecuentes embalses para contaminantes.

Prácticas óptimas ampliadas para la esterilidad a largo plazo

Diseño y flujo de trabajo de laboratorio

El diseño físico del laboratorio de cultura celular puede ayudar o dificultar la esterilidad. Idealmente, el laboratorio debe tener un área dedicada “limpiada” separada de los espacios generales de microbiología o biología molecular. La presión de aire positiva en la sala de cultivo celular (relativa al pasillo) obliga a ventilar, evitando la entrada de aire sin filtrar.

  • Tráfico de habitaciones: Limite el acceso al personal capacitado. No utilice la sala de cultura celular como un paseo o área de almacenamiento. Publice una señal fuera: “Cell Culture Lab – Personal autorizado – No entre si tiene un frío o una herida fresca”.
  • ] flujos separados limpios y sucios: Idealmente, debe haber un “corredor limpio” para la entrada (ganar, almacenar suministros estériles) y una ruta separada para la eliminación de residuos. Aunque esto es un lujo en muchas instalaciones, simplemente designar un banco limpio y un banco de residuos dentro del laboratorio puede ayudar.

Vigilancia y pruebas para la contaminación

La vigilancia de rutina es esencial, incluso cuando no se evidencia contaminación visible. Los laboratorios de cultivo celular deben tener un plan de vigilancia de la contaminación que incluye:

  • Pruebas de micoplasma: Usa métodos basados en PCR o basados en la cultura para la detección de micoplasma. Prueba todas las nuevas líneas celulares al recibir y prueba culturas establecidas mensualmente. Muchas instalaciones básicas o servicios comerciales ofrecen pruebas confiables.
  • ]Prueba bacteriana y fúngica: Inocular un pequeño coco de supernatante de cultura (o medio gastado) en brote de soja pétptica y medio tricolato. Incubar a 30–37°C durante 14 días; inspeccionar visualmente diariamente para la turbididad.
  • Muestra superficial: Swab Superficies BSC, interiores de incubadoras y topes de banco con un hisopo de algodón estéril, luego encaje sobre placas de agar de sangre. Incubar y contar unidades de formación de colonias para monitorear la eficacia de su régimen de limpieza.
  • Pruebas de calidad de sus aires: Usar placas de asentamiento (pantallas de petri abierta con agar) queden dentro del BSC y en la habitación durante 1-4 horas.

Manejo de la contaminación sospechosa

A pesar de los mejores esfuerzos, la contaminación todavía puede ocurrir. Actúa rápidamente:

  1. Isola el recipiente: Mover la cultura contaminada a un área de cuarentena lejos de otras culturas. No lo abras en el BSC principal.
  2. Identificar el contaminante: Examinar la morfología mediante microscopía (la bacteria puede ser varillas o cocci; hongos mostrar hifae). Realizar una mancha de Gram si es necesario.
  3. Intento de rescate (si es crítico): Para micoplasma, utilice un régimen de eliminación validado (por ejemplo, tratamiento con BM‐Cyclin o Plasmocin). Para bacterias o hongos, la descontaminación es raramente exitosa; es generalmente más seguro descartar la cultura y obtener un nuevo frasco de la acción original.
  4. Decontaminar el BSC y el equipo: Usar un esporicidio o lejía para limpiar completamente el gabinete, incubador y cualquier artículo que pueda haber sido expuesto.
  5. Documentar el evento:] Recordar lo que sucedió, la fuente probable y las acciones correctivas adoptadas. Usa esta información para mejorar los protocolos.

Formación y Cultura de la Asís

El equipo más caro en el laboratorio de cultura celular es inútil si la técnica del operador es pobre. ] La formación initial y continua es crítica. Se debe observar a un nuevo personal que realiza trabajo de cultura burda (utilizando agua estéril o coloración de alimentos en lugar de culturas vivas) antes de poder trabajar con células.

  • Talleres y auditorías: Realizar auditorías periódicas de técnica aséptica, por ejemplo, tener un experimentado reloj técnico un aprendiz y marcar cada paso (lavado de manos, carga de BSC, tuberías, cerramiento de buques).
  • Checklists:] Crear una lista de verificación diaria que incluye: “¿He limpiado el BSC antes de comenzar? ¿Son desinfectados los guantes? ¿Están todos los artículos colocados en el BSC antes de traer culturas? Uselo como un refrescante mental.
  • Orientación de libro abierto: Publica una tarjeta de referencia rápida laminada dentro del área de BSC resumiendo los pasos clave: lavar las manos, el pulverizador de etanol, materiales de carga, el recipiente abierto, la transferencia, el recipiente cercano, eliminar, limpiar.

Consideraciones especiales para las células primarias y las células madre

Las células primarias (por ejemplo, los fibroblastos humanos, los hepatocitos) y las células madre pluripotente inducidas (iPSC) son generalmente más sensibles y requieren una esterilidad aún más estricta. Se derivan a menudo de muestras de tejido que pueden llevar a organismos comunitarios de bajo nivel. Uso de dobles antibióticos

Higiene de incubadoras y suministro de gas

El incubador es un ambiente cálido y húmedo donde florecen los contaminantes. Mantenimiento de la orina incluye limpiar las estanterías y las puertas semanales, limpiar la cacerola con un desinfectante mensual, y reemplazar filtros de HEPA (si están equipados) por recomendaciones del fabricante. Utilice una cacerola de agua con cable de cobre o agregue una solución de sulfato de cobre (no μ2 para inhibir las líneas de crecimiento).

Conclusión

Cultura[LT] La práctica de la célula es una disciplina continua que exige atención al detalle en cada etapa, desde el diseño arquitectónico y la calidad del aire del laboratorio hasta el lavado diario de células y la eliminación final del gabinete de bioseguridad. Al identificar las principales fuentes de contaminación, adoptar prácticas sólidas asépticas, implementar monitoreo rutinario e invertir en entrenamiento de personal, los investigadores pueden reducir drásticamente el riesgo de perder valiosas culturas.