Utilizando cuentas magnéticas para la separación celular en la cultura

Introducción a la separación de células basadas en cuentas magnéticas

La separación celular es una técnica de piedra angular en la biología y la medicina moderna, permitiendo a los investigadores aislar poblaciones celulares específicas de mezclas heterogéneas para el análisis, la cultura o el uso terapéutico aguas abajo. Entre las diversas tecnologías de separación, los métodos basados en cuentas magnéticas han adquirido una adopción generalizada debido a su combinación de velocidad, simplicidad y manejo suave. Estos métodos dependen de cuentas superparamagnéticas funcionalizadas con anticuerpos o nidos que se un laboratorio de diagnóstico

Fundamentos de cuentas magnéticas

Los abetos magnéticos son típicamente partículas esféricas con diámetros que van desde los nanometros hasta los micrometros, compuestos por una matriz de polimérico o silica impregnada con nanopartículas magnéticas (a menudo óxido de hierro, Fe₃]4 o γ-Fe[LT6]

Principios de separación de células magnéticas

El proceso de separación puede dividirse en dos enfoques principales: selección positiva y selección negativa (depleción). En selección positiva, las cuentas se conjugan a anticuerpos que reconocen a la población de células objetivo. Después de incubación, las células con punta de cuentas son capturadas por un campo magnético, mientras que las células sin límites se descartan. En selección negativa, las cuentas se unen a las células no deseadas, que se eliminan magnéticamente, dejando las células funcionales raras se etiquetan a las células de las últimas

Pasos en la separación magnética

1. Preparación de muestra:] Desagregación de tejidos, centrifugación gradiente o lisis de glóbulos rojos para obtener una suspensión de una sola célula. La filtración a través de una malla de 30–40 μm se realiza a menudo para eliminar los bultos.
2. Incubación con cuentas magnéticas: La suspensión celular se mezcla con una cantidad predeterminada de conjugado de cuentas anticuerpos. Las condiciones de incubación (tiempo, temperatura, agitación) se optimizan para maximizar la unión al minimizar la adherencia no específica.
3. Captura magnética: La mezcla se coloca en un campo magnético (utilizando un imán permanente en una columna, tubo o formato de placa). Las células con borde de cuentas migran hacia el imán, mientras que las células sin límites se lavan.
4. Pasos de correa: Múltiples lavados con amortiguación (a menudo PBS con 0,5% BSA y 2 mM EDTA) eliminan las células sin límite contaminantes y las cuentas residuales.
5. Recuperación: Para una selección positiva, las células capturadas pueden ser eludidas eliminando el imán y reutilizando la pellets. Alternativamente, las células pueden ser utilizadas directamente en el imán para ensayos posteriores.

Tipos de sistemas de separación magnéticos

Existen varias plataformas comerciales, optimizadas para diferentes niveles de rendimiento y automatización. Entre las más comunes se encuentran:

• Sistemas basados en el colon (por ejemplo, Miltenyi Biotec MACS): Las células pasan por una columna de lana de acero colocada en un campo magnético fuerte. Se mantienen las células etiquetadas con cuentas, mientras que las células no etiquetadas fluyen a través. La columna se lava y luego se retira del imán para eludir la fracción de límite elevado.
• Sistemas basados en tubos o basados en placas (por ejemplo, Dinas, StemSep): Las células mezcladas con cuentas se colocan en un tubo o microplaca cerca de un imán. Las células con punta de cuentas se tiran al lado o al fondo, y el supernatante se elimina. Este enfoque es más sencillo y rápido pero puede tener menor rendimiento.
• Dispositivos microfluídicos: Las tecnologías emergentes utilizan microcanales con imanes integrados o gradientes de campo magnético para separar células a nivel de una sola célula. Estas son prometedoras para el aislamiento celular raro pero no son todavía convencionales.

Ventajas sobre métodos tradicionales

La separación de cuentas magnética ofrece varias ventajas en comparación con la clasificación de citometría de flujo (FACS) o la centrifugación de gradiente de densidad:

• Paso: Los protocolos típicos tardan 30-60 minutos, en comparación con las horas para FACS, lo que lo hace adecuado para procesar múltiples muestras simultáneamente.
• ]Scalability:] De 10⁵ a 10¹⁰] se pueden procesar células en una sola carrera, dependiendo del sistema. Esto es crucial para terapias celulares en escala clínica.
• Simbolidad: No hay instrumentación costosa (sólo un imán requerido) y entrenamiento mínimo del operador. El protocolo es sencillo y reproducible.
• Manejo de la energía: Las fuerzas de la manada son bajas, y las células no están sujetas a alta presión o campos eléctricos. La viabilidad normalmente supera el 90%.
• Versatilidad:] Aplicable a múltiples tipos de células, incluyendo células primarias, células madre, bacterias e incluso organelas subcelulares. Las cuentas también pueden ser funcionalizadas para la captura de proteínas o ácidos nucleicos.

Consideraciones y limitaciones

A pesar de sus beneficios, la separación de cuentas magnética tiene cavernas. La eliminación de cuentas debe ser considerada para aplicaciones donde las cuentas pueden interferir, como en ensayos funcionales o trasplante. Algunos sistemas permiten desprendimiento de cuentas enzimáticas o mecánicas, pero esto puede afectar la viabilidad celular o expresión de marcadores. Además, la unión de cuentas a los antígenos de superficie celular puede provocar señalización o activación, alterando el comportamiento celular.

Aplicaciones en Investigación y Medicina

La separación de células magnéticas se utiliza ampliamente en la biomedicina.

Inmunología

Isolación de subconjuntos de células T (por ejemplo, CD4+, CD8+), células B, células asesinas naturales, células dendritas y monocitos para ensayos funcionales, perfiles de citocinas o experimentos de transferencia adoptiva. Se prefiere la selección negativa para las células T no tocadas para evitar la activación.

Investigación sobre el cáncer

Enriquecimiento de células tumorales circulantes (CTC) de sangre utilizando las cuentas anti-EpCAM o anti-HER2 que permiten un monitoreo no invasivo de la progresión tumoral y la respuesta al tratamiento. Asimismo, las células madre del cáncer pueden enriquecerse en función de la expresión CD44/CD24.

Biología de células madre

Selección positiva de células madre hematopoyéticas (CD34+) de la médula ósea o de la sangre periférica movilizada para el trasplante. Las células madre mesenquimales (MSC) a menudo se aíslan por selección negativa para eliminar las células no deseadas.

Medicina regenerativa

La fabricación de terapia celular depende de la separación magnética para purificar las poblaciones de células terapéuticas antes de la infusión. Por ejemplo, las células T para la terapia CAR-T están aisladas por cuentas magnéticas antes de la modificación genética.

Microbiología

Las cuentas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos para los antígenos bacterianos o virales permiten la detección o el aislamiento de patógenos de muestras complejas. Esto se utiliza en la seguridad alimentaria y el diagnóstico clínico.

Future Directions and Innovations

La esfera sigue evolucionando. Entre los acontecimientos recientes se cuentan:

• Separación multiparamétrica: Usando varios tipos de cuentas con diferentes propiedades tamaño/magnéticas para aislar simultáneamente a múltiples poblaciones.
• Automatización y microfluidics: Integración con robots de manipulación líquida para el procesamiento de muestras de bajo volumen de alto rendimiento.
• Diseños de cuentas mejorados: Carillas biodegradables que degradan después de la internalización, o cuentas de nanoescala que pueden utilizarse para la entrega intracelular.
• Combinación con otras tecnologías: Pre-enriquecimiento con cuentas magnéticas seguido por FACS para poblaciones ultra-puras.

A medida que la tecnología de cuentas magnética madura, es probable que sea aún más integral a la medicina personalizada y las terapias basadas en células.

Conclusión

La separación de células de cuentas magnéticas ha transformado la forma en que los investigadores aíslan y purifican tipos de células específicos de mezclas complejas. Con su combinación de velocidad, simplicidad y manejo suave, es una herramienta indispensable tanto en investigación básica como en aplicaciones clínicas. Entendiendo los principios, eligiendo el sistema adecuado, y optimizando protocolos son cruciales para obtener células de alta pureza y viables.

Para más lectura: Miltenyi et al. – Separación celular magnética (Biotecnología de la naturaleza), Revisión de cuentas magnéticas en aislamiento celular (Métodos de inmunología),