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La citología de flujo es una tecnología de piedra angular en la biología celular moderna, permitiendo a los investigadores analizar rápidamente las propiedades físicas y químicas de miles de células individuales por segundo. Esta técnica es indispensable para caracterizar las poblaciones celulares en la cultura, desde controles de viabilidad simples hasta complejos inmunofenósticos multiparamétricos. Combinando fluidos, opticos y electrónicos, la citometría de flujo proporciona datos cuantitativos, multidimensionales que profundizan nuestra comprensión de la capacidad celular
¿Qué es la citometría de flujo?
El flujo de la citometría consiste en suspender las células en un líquido de vaina que las centra hidrodinámicamente en un flujo de un solo fichero. Este flujo pasa a través de un punto de interrogación, por lo general uno o más rayos láser. Cada célula intersecciona el láser, dispersa la luz y emite fluorescencia si lleva anticuerpos o disipes de color fluorescente.
Hidrodinámica Focusing y la célula de flujo
El corazón de cualquier citometro de flujo es la célula de flujo, una boquilla que acelera el flujo de muestra utilizando un líquido de vaina circundante. El perfil de flujo laminar obliga a las células al centro de la corriente, asegurando una iluminación láser consistente. El enfoque hidrodinámico adecuado minimiza la obstrucción y evita que se contemplen como eventos únicos. Los instrumentos modernos a menudo utilizan la capacidad de las células con base de cuvette o jet-off.
Scattering ligero: FSC y SSC
Cuando un rayo láser golpea una célula, la luz se dispersa en todas las direcciones. La dispersión avanzada (recogida en ángulos pequeños, normalmente 1–10 grados) es proporcional al diámetro celular y es una buena medida de primera aproximación del tamaño celular. La dispersión lateral (recogido a 90 grados) refleja las estructuras internas: células con muchos gránulos, como los neutrófilos, tienen SSC alta; los linfocitos pueden activar dos parámetros de muestra más bajos.
Detección de fluorescencia y análisis de multiparametros
Para un análisis más específico, las células se manchan con fluoróforos, ya sea con anticuerpos conjugados directamente, colorantes fluorescentes (por ejemplo, para el contenido de ADN), o sondas de células vivas (por ejemplo, para el flujo de calcio). Cada fluoróforo tiene un espectro de excitación y emisión característico.
Componentes clave de la instrumentación
Comprender los componentes principales de un citometro de flujo ayuda a los investigadores a optimizar la configuración y resolver problemas.
- Sistema de Fluidas: Proporciona muestras y líquido de vaina bajo presión controlada. Debe mantenerse para evitar burbujas de aire, bloqueos y contaminación cruzada.
- Optics: Incluye láseres (estado sólido, gas o diodo), lente, espejos y filtros. Potencia láser y alineación impactan directamente la sensibilidad y la relación de señal a ruido.
- Electrónico: Los PMT convierten fotones en señales eléctricas. El procesamiento de señales incluye amplificación (linear o logarítmica), umbral y procesamiento de pulsos para la discriminación de doblez.
- ] Software de adquisición y análisis de datos: Plataformas modernas (por ejemplo, BD FACSDiva, Beckman Coulter Kaluza o alternativas de código abierto como FlowJo) configuración de instrumentos de control, datos de registro, y permitir la visualización y la medición de flujo.
Fluorocromos y diseño de panel: Evitar las caídas
Es crucial seleccionar los fluoróforos adecuados para un panel multicolor. Los fluoróforos ideales tienen emisión brillante, sola superposición espectral y compatibilidad con las líneas láser disponibles. La superposición ocurre cuando el espectro de emisión de un fluoróforo se derrama en el PMT dedicado a otro. Esto se corregía a través de ] compensación]: una subtracción matemática de los controles de la compensación de la sola capa
Otra consideración es controles de fluorescencia-menos uno (FMO)]—samples manchados con todos los reactivos excepto uno. Los FMO revelan el máximo posible fondo diseminado de otros fluoróforos en ese canal, que es esencial para distinguir los positivos dim de los negativos. Para el trabajo de la cultura celular, autofluorescencia (por ejemplo, de células fluorescentes selectas o granularescentes)
Aplicaciones en Análisis de la Cultura Celular
La citometría de flujo ofrece un kit de herramientas versátil para caracterizar las células en la cultura. A continuación se presentan algunas de las aplicaciones más comunes, cada una que requiere estrategias específicas de preparación y control de muestras.
Evaluación de la viabilidad celular
La determinación de la fracción de células vivas, apoptóticas y muertas es fundamental para muchos experimentos. Los tintes de viabilidad, como el ioduro propidium (PI) o 7-aminoactinomycin D (7-AAD), se excluyen por las membranas intactas y por lo tanto se manchan sólo células muertas.
Análisis del ciclo celular
El análisis de ADN mediante tintes fluorescentes (propidium iodide, DAPI, Hoechst 33342) revela la proporción de células en las fases G0/G1, S y G2/M. Un histograma de contenido de ADN muestra dos picos: un pico G0/G1 (2n DNA) y un pico G2/M de proliferación (4n DNA), con células intermedias de fases de interse
Detección de apoptosis
La cistola de flujo puede diseccionar múltiples pasos de apoptosis. El ensayo clásico utiliza el Anexo V conjugado a un fluoroforo (por ejemplo, FITC) para detectar la fosfatilserina externaizada en la membrana plasmática, combinado con un tinte de viabilidad como PI. Las células apoptóticas tempranas son el Anexo V+ / PI-, mientras que los apoptóticos tardíos son células dobles.
Seguimiento de la proliferación celular
El seguimiento de las células divisorias a lo largo del tiempo se puede realizar con tintes como carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) o CellTrace Violet. Estos tintes se unen covalentemente a las aminas intracelulares y se distribuyen igualmente a las células hijas en división. Cada ciclo de división reduce la intensidad media del tallo por aproximadamente la mitad.
Inmunofenóstil
En las células inmunitarias cultivadas, identificar los subconjuntos por los marcadores superficiales (por ejemplo, CD4 vs. CD8 en las células T, CD19 en las células B) es rutinario. Los paneles a menudo incluyen 5-15 marcadores para definir la activación, la memoria o estados regulatorios. Se realiza la tinción extracelular en las células viables; si se necesitan citocinas intracelulares o factores de transcripción (por ejemplo, tibo)
Clasificación celular (FACS)
La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) extiende el análisis a la purificación. La boquilla del citometro vibra para crear gotas; el instrumento carga eléctricamente gotas que contienen las células deseadas y las desvía en tubos de recogida (o placas). La clasificación conserva la viabilidad celular si se realiza bajo condiciones estériles con líquido de vaina adecuado.
Preparar células para la citometría de flujo: mejores prácticas
Sin la adecuada preparación de muestras, incluso el mejor instrumento no puede producir datos fiables.
- ]Arreglamiento de células del sistema: Los clústeres causan eventos de doblez que deben ser excluidos durante el cálculo. Las células del filtro a través de un tensor de 40 μm o 70 μm inmediatamente antes del análisis. La disociación enzimática (por ejemplo, trippsin/EDTA para células adherentes) debe ser suave para evitar los epitopes de superficie dañiles.
- Bloqueo: Incuba células con suero (de la misma especie que los anticuerpos secundarios) o antídopos purificados del receptor Fc para reducir la unión no específica.
- Titulación anticuerpo: Usa diluciones en serie para determinar la concentración óptima que produce la mayor relación señal-al-noise (a menudo la concentración mínima que da la máxima separación entre las poblaciones positivas y negativas).
- Mantiene:] Incubar en la oscuridad a 4°C durante 20–40 minutos (o según lo recomendado por el fabricante). Incluir pasos de lavado con un búfer adecuado (PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA).
- Controles: Incluir el control no detenido, controles de una sola mancha para la compensación, y controles de la FMO para identificar los límites de las puertas. Los controles de Isotype son menos fiables pero pueden utilizarse para evaluar la unión no específica del anticuerpo primario.
- Fixación: Si las células no pueden ejecutarse inmediatamente, fijarse con paraformaldehído 1–4% y almacenar a 4°C. Tenga en cuenta que la fijación puede alterar las propiedades de dispersión y puede enmascarar ciertos epitopes.
Analizar datos e interpretación de resultados
El análisis de datos es un proceso iterativo de trama, gating y refinación. El flujo de trabajo típico incluye:
1. Creación de una puerta de célula viva
Parcela FSC-Area (FSC-A) vs. SSC-Area (SSC-A). Las células vivas generalmente forman un grupo distinto. Los desechos aparecen como pequeños eventos de baja estatura; las células muertas a menudo se desplazan en la dispersión. Refinar incluyendo una puerta de colorante viabilidad para excluir las células muertas.
2. Doble discriminación
Parcela FSC-A (área) vs. FSC-H (altura) para células individuales. Las células individuales caen a lo largo de una diagonal; los dobletes tienen un área superior relativa a la altura. Alternativamente, use FSC vs. FSC-W (aldad). Este paso es obligatorio al analizar el contenido de ADN o ordenar.
3. Puertas fluoroforas-específicas
Utilizando los datos compensados, trama cada canal de fluorofre contra un control negativo (por ejemplo, FMO) para identificar poblaciones positivas. Para marcadores bimodales (por ejemplo, CD4), la puerta es simple. Para marcadores continuos (por ejemplo, activación), utilice cortes basados en la población (por ejemplo, 95 percentil de control negativo) o poblaciones de referencia biológica (por ejemplo, células TDR para HLA).
4. Informes estadísticos
Informe el porcentaje de células en cada puerta (promedio de réplicas con desviación estándar) y, cuando sea apropiado, intensidad mediana de fluorescencia (MFI) o media geométrica. Para ciclo celular, utilice software de modelado para estimar las fracciones de fase. Para la proliferación, calcule el índice de proliferación o índice de división.
Problemas comunes para resolver problemas
| Issue | Possible Cause | Solution |
|---|---|---|
| Low event rate or clogging | Cell aggregates or debris | Filter sample; add adequate EDTA; reduce cell concentration |
| High background fluorescence | Dead cells autofluoresce; antibody aggregates; insufficient blocking | Use live/dead gates; spin antibodies to remove aggregates; increase Fc block |
| Unstable baseline or drift | Temperature changes; air in fluidics; laser instability | Warm up instrument; prime fluidics; monitor laser power |
| Unexpected shifts in compensation | PMT voltage changed; different lot of antibody | Titrate new antibody; re-compensate each day; use consistent PMTs |
Limitaciones y consideraciones
Aunque la cistola de flujo es potente, tiene limitaciones. Los datos se recogen en células individuales en suspensión; contexto espacial ( arquitectura de la isla) se pierde. La técnica es semicuantitativa; mientras que las diferencias relativas en la MFI son números robustos, moléculas absolutas requieren cuentas de calibración (por ejemplo, QuantiBRITE). Paneles de alta dimensión (≥15 colores) requieren controles cuidadosos y compensación avanzada, aumento de la complejidad y supervivencia de células espaciales.
Futuros rumbos en la citometría de flujo para la cultura celular
El campo está evolucionando rápidamente. La citómetría de flujo episcopal mide la emisión completa de cada fluoróforo en lugar de depender de filtros de banda, permitiendo una mejor separación de los disipes de sobresueltos y el uso de más parámetros en un solo panel.
Conclusión
[LT] La citometría de flujo sigue siendo una herramienta esencial para analizar las poblaciones de células en la cultura. Desde controles de viabilidad básicos hasta la clasificación de múltiples parámetros y células, proporciona datos cuantitativos y de resolución de células únicas que son difíciles de obtener por otros medios.