Introduction au génie cellulaire fondé sur le CRISPR

L'avènement de la technologie des répétitions palindromiques courtes (CRISPR) interespaces régulièrement a fondamentalement transformé la façon dont les chercheurs manipulent le génome des cellules cultivées. En permettant des modifications précises et programmables à presque n'importe quel endroit dans un génome eucaryotique, les systèmes CRISPR permettent aux scientifiques de créer des lignées cellulaires isogéniques, d'effectuer des écrans génomiques fonctionnels et de construire des modèles de maladies précis dans un plat.

Cet article présente un aperçu technique complet de l'application du CRISPR pour modifier les cellules cultivées. Nous couvrons les composantes principales du CRISPR-Cas9, les protocoles détaillés de livraison et de sélection, les stratégies de montage avancées, les pièges communs et les innovations émergentes qui font avancer le terrain. L'objectif est de donner aux chercheurs nouveaux et expérimentés un guide pratique et prêt à la production pour l'utilisation du CRISPR dans leurs flux de travail de culture cellulaire.

Composantes essentielles du CRISPR-Cas9

Le CRISPR-Cas9 se compose de deux molécules essentielles : une endonucléase de Cas9 et un seul ARN guide (sgRNA). L'ARNg contient une séquence d'espacement de 20 nucléotides qui est complémentaire à la région d'ADN cible, suivie d'un échafaudage qui lie Cas9. Pour que Cas9 puisse couper, l'ADN cible doit être immédiatement suivi d'un court motif adjacent protospacer (PAM), typiquement NGG pour Streptococcus pyogenes Cas9. Lorsque le sgRNA et Cas9 forment un complexe de ribonucléoprotéine (RNP), ils scannent le génome pour trouver une correspondance avec les séquences de PAM; une fois qu'on en trouve une, Cas9 induit une rupture à double brin (DSB) environ trois paires de base en amont du PAM.

Les chercheurs peuvent concevoir des ARNg en utilisant des outils tels que CHOPCHOP[ pour maximiser l'activité sur cible et minimiser le potentiel hors cible. L'OBD est ensuite réparé par l'une des deux voies endogènes : l'assemblage de bout non homologus (NHEJ), qui est sujet à erreur et introduit de petites insertions ou suppressions (indels) qui peuvent perturber la fonction génique; ou la réparation dirigée par homologie (HDR), qui utilise un modèle de donneur exogène pour insérer des modifications précises ou des cassettes de reporteur.

NHEJ: Mutations de knockouts et d'indel

Pour la plupart des études sur la perte de fonction, le NHEJ est la voie privilégiée. En fournissant Cas9 et un ARNg ciblant un exon codant, les chercheurs génèrent un mélange d'indels qui provoquent des changements de cadre ou des codons d'arrêt prématurés. Après une période de récupération, les cellules sont clonées et séquencées pour vérifier l'exon. Cette approche est largement utilisée pour créer des allèles nuls dans les lignées cellulaires pour étudier l'essentielnalité génétique, les voies de signalisation et la sensibilité aux médicaments.

HDR: Knockins et modifications précises

Lorsqu'une modification précise est nécessaire, comme l'insertion d'une étiquette fluorescente, d'une mutation ponctuelle ou d'un allèle conditionnel, le HDR est utilisé. L'efficacité du HDR dans les lignes cellulaires immortalisées est généralement faible (1-10 %) et nécessite la co-livraison d'un modèle de donneur. Le donneur peut être un oligonucléotide à brin unique (sssODN) pour les petites modifications ou un bras d'homologie à base de plasmide pour les plus grands inserts.

Fournir des composants CRISPR dans des cellules cultivées

Le succès d'une expérience CRISPR dépend fortement de la livraison efficace de la protéine Cas9 et de l'ARNg dans le noyau. Plusieurs méthodes sont disponibles, chacune avec des avantages et des limitations. Le choix dépend du type de cellule, du budget et du débit souhaité.

Lipogénèse

Lipofection utilise des réactifs lipidiques cationiques pour former des complexes avec l'ADN plasmidique codant Cas9 et sgRNA. Il est simple et fonctionne bien pour des lignées faciles à transfecter telles que HEK293T, HeLa, et de nombreuses lignées cellulaires cancéreuses. Cependant, la lipofection est moins efficace pour les cellules primaires, les cellules souches et les cellules de suspension. La présence d'ADN plasmidique peut également causer des réponses immunitaires innées dans certains types de cellules.

Électroporation

L'électroporation applique une courte impulsion électrique pour perméabiliser transitoirement la membrane cellulaire, permettant l'entrée de complexes ADN, ARN ou RNP. Des systèmes modernes comme le Nucleofector Lonza ou le Thermo Fisher Neon offrent une efficacité élevée même dans les cellules difficiles à transfecter, y compris les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et les cellules T. L'électroporation de complexes RNP — protéine Cas9 préformée liée au sgRNA — est particulièrement populaire car elle élimine le risque d'intégration plasmique et permet une édition rapide (détectable en 24 à 48 heures).

Vecteurs viraux

Pour les cellules réfractaires à la transfection, la transduction virale constitue une alternative fiable. Les vecteurs lentiviraux peuvent intégrer de façon stable les cassettes d'expression Cas9 et sgRNA, ce qui les rend idéales pour les écrans CRISPR groupés. Les vecteurs adéno-associés au virus (AVA) sont également utilisés pour la livraison de modèles de donneurs dans les expériences HDR, bien que leur capacité d'emballage soit limitée (~4,5 kb).

Méthodes de micro-injection et de nanoparticules

La microinjection est une activité à forte intensité de main-d'oeuvre, mais peut atteindre une précision unique, souvent utilisée pour l'édition de zygotes dans la production animale transgénique. Plus récemment, des nanoparticules lipidiques et des nanoparticules d'or ont été développés pour la livraison transitoire de l'ARNm et de l'ARNg Cas9, offrant une alternative non virale avec une immunogénicité plus faible.

Sélection, enrichissement et validation des cellules modifiées

Après la livraison, seul un sous-ensemble de cellules sera chargé de la modification souhaitée. Les stratégies d'enrichissement sont essentielles pour obtenir une population pure pour les expériences en aval.

Rédacteurs et FACS fluorescents

L'inclusion d'un reporter fluorescent (p. ex. GFP ou BFP) dans la cassette d'édition ou l'utilisation de la co-livraison d'un marqueur fluorescent séparé permet de trier les FACS pour isoler les cellules modifiées avec succès.

Sélection des antibiotiques

Si un gène de résistance à la puromycine, à la blasticidine ou à la néomycine est introduit, la sélection des antibiotiques peut rapidement enrichir les cellules modifiées. Cependant, cette méthode ne fait pas de distinction entre les cellules qui ont intégré le gène de résistance au locus cible et les événements d'intégration aléatoire, de sorte qu'une validation supplémentaire est nécessaire.

Génotypage et validation

Pour les clones à éclaboussures, il est recommandé de combiner le séquençage à travers le site de coupe et le séquençage occidental pour la perte de protéines. Pour les cognacs, le PCR à longue portée couvrant les deux bras d'homologie peut confirmer l'intégration correcte et le séquençage de jonction peut exclure les indels aux jonctions de réparation.

Applications des cellules modifiées du CRISPR dans la recherche

La gamme de questions expérimentales qui peuvent être abordées à l'aide de cellules éditées par le CRISPR est vaste.

Écrans génomiques fonctionnels

Après avoir sélectionné un phénotype (p. ex., survie cellulaire sous traitement médicamenteux ou résistance à une infection virale), le séquençage profond des ARNg intégrés identifie les gènes essentiels au processus. Cette approche a permis de découvrir de nouvelles vulnérabilités au cancer, des facteurs d'hôte pour les pathogènes et des régulateurs des réponses immunitaires.

Modélisation des maladies avec les lignées cellulaires isogéniques

En introduisant des mutations spécifiques au patient dans une lignée cellulaire témoin, les chercheurs créent des modèles isogéniques qui ne diffèrent que par la mutation d'intérêt.Cela élimine les effets de fond génétiques confusionnels. Par exemple, l'introduction de la mutation BRCA1 185delAG dans les cellules épithéliales mammaires MCF10A permet une étude précise de la façon dont cette altération unique affecte la réparation de l'ADN et la tumeur.

Interférence et activation du CRISPR (CRISPRi/a)

Cas9 (dCas9), mort par catalyse, fusionné à des répresseurs transcriptionnels (par exemple KRAB) ou à des activateurs (par exemple VP64), permet la modulation de l'expression des gènes sans couper l'ADN. CRISPRI peut réduire au silence les gènes à haute spécificité, tandis que CRISPRa peut déréglementer les gènes endogènes.

Traçage et codage par barcage

En fournissant une bibliothèque de séquences de codes-barres uniques via HDR dans un locus portuaire sûr, les chercheurs peuvent suivre la dynamique clonale des populations cellulaires au fil du temps. Cette technique, connue sous le nom de code-barres CRISPR ou CARLIN, révèle comment les cellules individuelles contribuent à la différenciation, à la métastase ou à la résistance aux médicaments.

Défis et obstacles techniques

Malgré son pouvoir, l'édition du CRISPR en culture cellulaire n'est pas sans difficultés, mais il est essentiel de reconnaître et d'atténuer ces défis pour obtenir des résultats reproductibles.

Effets hors objectif

Cas9 peut tolérer des erreurs d'appariement dans le duplex sgRNA:ADN, ce qui entraîne des modifications non intentionnelles ailleurs dans le génome. Les mutations hors-cible peuvent confondre l'analyse phénotypique et induire des expériences en aval. Les stratégies pour minimiser les effets hors-cible comprennent l'utilisation de variantes de Cas9 à haute fidélité (p. ex. eSpCas9, SpCas9-HF1), la sélection d'ARNg avec des scores de spécificité élevés et la validation expérimentale des sites hors-cible prévus par le haut par séquençage ciblé.

Faible efficacité des rapports HDR

Pour améliorer le HDR, les chercheurs peuvent synchroniser les cellules en phase S en utilisant des inhibiteurs chimiques (p. ex., nocodazole), utiliser de petites molécules qui suppriment le NHEJ (p. ex., inhibiteurs du SCR7 ou du PKcs-ADN), ou fournir des complexes de protéine-RNP de Cas9 purifiés avec des modèles de donneur modifiés qui ont des liens phosphorothioate.

Mosaic et variation de la clone

Même après le clonage à cellules uniques, toutes les cellules d'une population ne peuvent pas être modifiées de la même façon en raison de l'expression prolongée de Cas9 ou de la réparation continue. Ceci est particulièrement problématique dans les cellules souches.

Toxicité des cellules et stress lié à la livraison

La transfection, l'électroporation et la transduction virale peuvent déclencher des réactions de stress cellulaire, y compris la signalisation de dommages à l'ADN et l'apoptose. En utilisant des protocoles optimisés, minimiser la quantité d'acide nucléique livré, et permettre un temps de récupération adéquat peut améliorer la santé cellulaire.

Considérations éthiques et réglementaires

Bien que l'édition des cellules en culture pour la recherche fondamentale soit conforme aux lignes directrices institutionnelles normalisées sur la biosécurité et l'ADN recombinant, plusieurs dimensions éthiques méritent une attention. Lorsque des cellules souches iPSC humaines ou embryonnaires sont utilisées, il peut être nécessaire d'exercer une surveillance supplémentaire de la part des comités de surveillance de la recherche sur les cellules souches.

Orientations futures et technologies émergentes

Le champ CRISPR continue d'évoluer rapidement. Ci-dessous sont les principaux développements qui promettent d'élargir encore la portée de l'édition de la culture cellulaire.

Édition de base

Les éditeurs de bases fusionnent un Cas9 (nickase) ayant une déficience catalytique en une enzyme de désaminase, permettant ainsi la conversion directe d'une paire de bases à une autre (par exemple C→T ou A→G) sans exiger un modèle DSB ou un modèle donneur. Cette technologie est idéale pour modéliser des mutations ponctuelles et corriger les SNP pathogènes dans les lignes cellulaires avec une efficacité élevée et des sous-produits indel minimes.

Édition principale

L'édition primaire utilise une nickase Cas9 fusionnée à une transcriptase inverse, ainsi qu'un guide d'édition primaire RNA (pegRNA) qui porte l'édition souhaitée. Il peut introduire des insertions, des suppressions et les 12 conversions de base à base possibles avec très peu d'éditions hors cible. Bien que la livraison dans la culture cellulaire soit plus complexe, l'édition primaire est rapidement en train de gagner en adoption pour une modification génétique précise.

Dans Vivo Édition et modèles organoid

Un nombre croissant d'études appliquent le CRISPR directement aux cellules des organoides ou en injectant des composants de correction sur des animaux vivants. Par exemple, la livraison de composants du CRISPR via AAV dans la rétine ou le foie des modèles de souris permet de corriger les défauts génétiques in situ. La combinaison du CRISPR avec les systèmes de culture organoid 3D offre une plateforme encore plus physiologiquement pertinente pour étudier le développement et la maladie.

Édition multiplexée et biologie synthétique

En utilisant simultanément plusieurs sgRNA, les chercheurs peuvent éditer plusieurs gènes à la fois, permettant la construction de circuits de gènes synthétiques ou la modélisation de maladies polygéniques. Des systèmes comme la MAD7 (Cas12a) nucléase, qui traite son propre réseau CRISPR, simplifient le multiplexage. De plus, CRISPR peut être utilisé pour intégrer de grands groupements de gènes synthétiques dans des locus portuaires sûrs, ouvrant la porte à la programmation du comportement cellulaire pour la biomanufacturing.

Considérations pratiques relatives au Protocole

Pour mettre en œuvre l'édition CRISPR en culture cellulaire, nous recommandons le workflow suivant:

  1. Conception 3–5 sgRNA par cible à l'aide d'algorithmes de prédiction validés (Doench et al., Biotechnologie de la nature, 2016.
  2. Les ARNg de clone dans un vecteur d'expression (p. ex., lentiCRISPRv2) ou l'achat de ARNg de synthèse chimiquement modifié.
  3. L'administration de Cas9 et de sgRNA par la méthode la plus appropriée pour votre type de cellule (électroporation NRP pour les cellules souches; lipofection plasmidique pour HEK293T).
  4. Laisser 48 à 72 heures pour l'édition, puis récolter l'ADN génomique et effectuer un essai T7E1 ou Surveyor pour estimer l'efficacité de l'édition.
  5. Enrichie les cellules éditées à l'aide d'un marqueur de sélection co-exprimé ou FACS, puis trier les cellules en plaques de 96 puits.
  6. Ecraner les clones par séquençage PCR et Sanger, et choisir au moins deux clones indépendants pour la validation phénotypique.
  7. Confirmer l'édition sur cible et vérifier les sites top off-cible par séquençage de prochaine génération.

Des protocoles détaillés sont disponibles auprès de Addgene="s CRISPR resource center, qui propose des plasmides, des protocoles et des guides de dépannage. Pour les écrans à haut débit, la plateforme de perturbation génétique de Broad Institutes fournit des bibliothèques et des outils d'analyse sgRNA pré-conçus.

Conclusion

La technologie CRISPR est devenue un outil indispensable pour modifier les cellules en culture, permettant aux chercheurs de disséquer la fonction génique, de modéliser les maladies humaines avec une précision sans précédent et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. En concevant soigneusement les ARNg, en choisissant les méthodes de livraison appropriées et en validant rigoureusement les clones modifiés, les scientifiques peuvent exploiter tout le potentiel du CRISPR pour faire progresser la découverte.