Les progrès du génie génétique ont permis de créer des possibilités sans précédent de production de produits naturels rares par fermentation microbienne, qui comprennent des alcaloïdes complexes, des terpénoïdes et des polykétides, mais leurs sources naturelles, souvent à croissance lente, des organismes marins cryptiques ou des espèces menacées, ne peuvent répondre à la demande industrielle. En repensant le métabolisme des bactéries, des levures et des champignons, les chercheurs peuvent maintenant synthétiser ces molécules précieuses dans des bioréacteurs contrôlés et évolutives. Ce passage de l'extraction à la biosynthèse promet de démocratiser l'accès aux médicaments qui sauvent la vie, de réduire la pression environnementale sur les habitats naturels et de permettre la découverte d'entités chimiques entièrement nouvelles.

La valeur et le défi des produits naturels rares

Les produits naturels ont toujours été la source la plus réussie de composés de plomb pour le développement de médicaments. Près de la moitié de tous les médicaments à petites molécules approuvés par la FDA entre 1981 et 2019 sont des produits naturels ou leurs dérivés. Cependant, la grande majorité des composés bioactifs trouvés dans la nature sont produits en quantités infimes, souvent dans le cadre de voies métaboliques complexes qui sont difficiles à reconstituer en dehors de l'organisme indigène. Par exemple, l'agent anticancéreux paclitaxel (Taxol) a été isolé à l'origine de l'écorce de l'ifier du Pacifique, exigeant six arbres pour produire suffisamment pour un seul patient.

Les produits naturels rares se répartissent généralement en plusieurs catégories chimiques :

  • Alcaloïdes — composés contenant de l'azote tels que la morphine, la codéine et la vinblastine, largement utilisés comme analgésiques et chimiothérapeutiques.
  • Terpénoïdes — un groupe diversifié comprenant le taxol, l'artémisinine et les cannabinoïdes, connus pour leurs propriétés anticancéreuses, antipaludiques et psychoactives.
  • Polyketides — grands antibiotiques macrolides comme l'érythromycine et la rapamycine, essentiels pour traiter les infections bactériennes et l'immunosuppression.
  • Péptipèdes non ribosomaux — cyclosporine, vancomycine et daptomycine, qui comprennent de puissants antibiotiques et immunosuppresseurs.

Comme ces molécules sont structurellement complexes et contiennent souvent de multiples centres chiraux, la synthèse chimique à l'échelle industrielle est prohibitivement difficile ou économiquement invivable. L'ingénierie microbienne offre un chemin pragmatique intermédiaire : exploiter la machine synthétique des cellules vivantes pour effectuer la chimie complexe que les chimistes ne peuvent pas faire correspondre.

Exemples de produits naturels rares de haute valeur

L'industrie pharmaceutique s'appuie sur plusieurs produits naturels rares dont les chaînes d'approvisionnement sont limitées par la rareté biologique ou les risques géopolitiques:

  • Artémisinine — Maintenant produit semi-synthétiquement dans l'ingénierie Saccharomyces cerevisiae, son précurseur de l'acide artémisinique est fabriqué par fermentation et transformé chimiquement en artémisinine, stabilisant l'approvisionnement mondial.
  • Resveratrol — Polyphénol aux propriétés antioxydantes, produit dans des Escherichia coli et levure pour des applications nutraceutiques.
  • Opioïdes — La thébaine et la codéine ont été synthétisées dans la levure de sucre, bien que les rendements demeurent sous-commerciaux.
  • Prostratin — Un ester de phorbols ayant une activité anti-VIH potentielle, isolé de l'arbre en voie de disparition Homalanthus nutans; la production microbienne pourrait éliminer le besoin de récolter la plante.

Ces exemples illustrent l'étendue des cibles et la faisabilité croissante de la production microbienne. Chacun présente des défis uniques selon la longueur de la voie, la disponibilité des enzymes et la toxicité des intermédiaires.

Ingénierie Organismes hôtes

La sélection du bon châssis microbien est essentielle. Trois grandes classes de micro-organismes sont couramment utilisées : les bactéries, les levures et les champignons filamenteux.

Bactéries en tant que plateformes de production

Les hôtes prokaryotiques tels que E. coli et Bacillus subtilis[ sont largement utilisés en raison de leur croissance rapide, de leur génétique bien caractérisée et de leur facilité de manipulation à haut débit. E. coli[, en particulier, a été conçu pour produire des dizaines de produits naturels complexes, dont le polykétide 6-désoxyerythronolide B (précurseur de l'érythromycine) et le terpénoïde amorphadienne (précurseur de l'artémisinine). Les principaux avantages sont notamment les suivants :

  • Courts temps de doublement (20-30 minutes) permettant le développement rapide des processus.
  • Boîte à outils étendue de plasmides, promoteurs et techniques de rédaction de gènes.
  • Compatibilité avec l'ingénierie métabolique sans cellules pour le prototypage de la voie.

Cependant, les bactéries manquent des capacités de modification post-traductionnelle et de compartimentalisation subcellulaire présentes dans les eucaryotes. De nombreuses voies d'origine végétale impliquent des enzymes du cytochrome P450 qui nécessitent l'intégration de la membrane et des partenaires de transport d'électrons, qui sont difficiles à exprimer fonctionnellement dans E. coli. De plus, l'accumulation d'intermédiaires ou de produits toxiques peut limiter les rendements.

Fungi à levure et à filamente

Les hôtes eucaryotiques, en particulier Saccharomyces cerevisiae (vêtements de baker) et Aspergillus nidulans, sont de plus en plus favorisés pour exprimer les grappes génétiques biosynthétiques végétales et fongiques.

  • Production indigène de terpénoïdes complexes par la voie mévalonate.
  • Systèmes compatibles cytochromes P450 avec réductases natives.
  • Une technologie de fermentation bien établie pour l'expansion industrielle.
  • Le statut de GRAS (généralement reconnu comme étant sûr) pour les applications alimentaires et pharmaceutiques.

Les champignons filamenteux comme Aspergillus et [Le péniclium[ sont des producteurs naturels de nombreux antibiotiques et mycotoxines. Leur tolérance à un pH bas et leur capacité à sécréter de grandes protéines les rendent attrayants pour certaines voies.

Techniques clés en génie microbien pour les produits naturels

L'ingénierie métabolique moderne intègre des outils de biologie synthétique, de biologie des systèmes et d'ingénierie évolutive pour reprogrammer le métabolisme microbien. Les techniques suivantes sont fondamentales.

CRISPR-Cas9 et édition de gènes

Le système CRISPR-Cas9 a révolutionné l'ingénierie microbienne en permettant des modifications précises et sans cicatrices aux génomes.

  • Éliminez les voies métaboliques concurrentes pour réorienter le flux de carbone vers la molécule cible.
  • Intégrer de grands groupes de gènes biosynthétiques (jusqu'à 100 kb) dans le génome pour une expression stable.
  • Introduire des mutations ponctuelles dans les enzymes de voie pour soulager l'inhibition de la rétroaction ou modifier la spécificité du substrat.
  • Effectuer des écrans à haut débit pour identifier les cibles génétiques qui améliorent le rendement.

Par exemple, chez la levure, le CRISPR a été utilisé pour intégrer 14 gènes codant la voie opioïde, permettant la production de novo de la thébaine. Dans E. coli, les effondrements médiés par le CRISPR des gènes du métabolisme central du carbone ont augmenté le rendement de l'alpha-bisabolène, précurseur des biocarburants et des parfums.

Ingénierie de trajectoire métabolique

Une fois qu'une voie est identifiée, elle doit être optimisée pour la production.

  • L'optimisation du codon de genre[ — La correspondance de l'utilisation du codon des gènes hétérologues avec le pool d'ARNt de l'hôte améliore l'efficacité de la traduction.
  • Ingénierie du promoteur — Utilisation de promoteurs constitutifs ou inductibles puissants pour ajuster les niveaux d'expression des gènes.
  • Variation du numéro de copie de genre — Introduction de multiples copies d'enzymes limitant la vitesse sur plasmides ou cassettes intégrées.
  • Équilibrage des voies de circulation[ — Réglage fin du rapport des enzymes pour éviter l'accumulation d'intermédiaires ou de goulets d'étranglement toxiques.
  • Régénération de cofacteur — Ingénierie de l'hôte pour fournir suffisamment de NADPH, ATP ou acétyl-CoA pour la voie.

Les approches avancées comprennent l'utilisation de systèmes de contrôle dynamiques qui détectent les concentrations de métabolites et ajustent l'expression des enzymes en temps réel, en imitant la régulation naturelle.

Expression hétérologue et biologie synthétique

De nombreux groupes génétiques de produits naturels sont cryptiques ou silencieux dans leurs hôtes indigènes. La biologie synthétique permet l'assemblage de grands groupes génétiques refactorés pour l'expression chez les hôtes hétérologues.

  • Méthodes d'assemblage d'ADN — L'assemblage de Gibson, le clonage de Golden Gate et la recombinaison homologue de levure permettent un assemblage flexible de plusieurs gènes dans une seule construction.
  • Refactoring[ — Remplacer les promoteurs natifs et les sites de fixation du ribosome par des parties normalisées pour obtenir une expression prévisible.
  • Refacturation des grappes de génération[ — Suppression d'éléments répressifs et introduction d'opérons synthétiques pour activer des grappes silencieuses.
  • Ingénierie en châssis — Enlever les gènes inutiles de l'hôte pour créer un génome épuré -lean-génomène qui canalise les ressources dans la voie souhaitée.

Notamment, la voie de l'artémisinine refactorée chez la levure a nécessité l'introduction de gènes provenant de trois royaumes différents (plante, bactérie et levure) et plus d'une décennie d'optimisation itérative pour atteindre la viabilité commerciale.

Évolution dirigée

Les enzymes de sources naturelles ont souvent une faible activité, une faible solubilité ou une spécificité du substrat incorrecte chez les hôtes étrangers. L'évolution dirigée imite la sélection naturelle pour améliorer ces enzymes.

  • Générer des bibliothèques de variantes enzymatiques par PCR ou par shuffling ADN.
  • Choisir ou sélectionner des fonctions améliorées, par exemple, un titre de produit plus élevé, une thermostabilité ou une inhibition réduite du produit.
  • Il doit être itéré jusqu'à ce que les performances souhaitées soient atteintes.

L'évolution d'une plante P450 (CYP71AV1) de Artemisia annua pour augmenter son activité dans la levure, qui était essentielle pour obtenir des titres d'acide artémisinique industriel. De même, l'évolution dirigée d'une polykétide synthase bactérienne a permis d'améliorer la production de l'érythromycine antibiotique.

Études de cas de réussite

Plusieurs procédés de production microbienne ont atteint ou approché l'échelle commerciale, démontrant la puissance de ces techniques techniques d'ingénierie.

Acide artémisinique dans le levure

La plus célèbre réussite est la production d'acide artémisinique, précurseur de l'artémisinine antipaludique. En utilisant S. cerevisiae, des chercheurs d'Amyris et de l'Université de Californie, Berkeley, ont obtenu des titres supérieurs à 25 g/L d'acide artémisinique dans la fermentation par lots nourris.

  • Surexpression de la voie mévalonate pour augmenter l'approvisionnement en précurseurs.
  • Introduction d'amorphadiène synthase et d'un cytochrome P450 (CYP71AV1) végétal avec son partenaire redox.
  • Dirigé l'évolution du P450 pour augmenter l'activité.
  • Ingénierie d'un transporteur dédié à l'exportation du produit de la cellule, réduisant la toxicité.

L'acide artémisinique qui en résulte est transformé en artémisinine par une simple étape chimique, stabilisant l'offre mondiale et réduisant la volatilité des prix. Ce procédé a été autorisé par Sanofi et a produit plus de 100 millions de doses.

Opioïdes dans le levure

En 2015, une équipe de l'Université Stanford a rapporté la première synthèse complète de la thébaine de précurseur opioïde du sucre dans la levure. Cette prouesse a nécessité l'ingénierie 21 enzymes hétérologues, y compris les gènes végétaux, bactériens et mammifères. Les principaux défis ont été l'expression d'un cytochrome complexe P450 (thébaine 6-O-déméthylase) et la gestion des intermédiaires toxiques.

Taxadiène dans E. coli

Le paclitaxel anticancéreux a une structure très complexe avec plusieurs centres chiraux et un anneau taxane tendu. La première étape engagée – la cyclisation du géranylgeranyl diphosphate en taxadiène – a été reconstituée avec succès dans E. coli. En surexprimant la voie bactérienne du méthylérythritol phosphate (MEP) et en introduisant la taxadiène synthase de l'if, les chercheurs ont obtenu des titres de 1 g/L de taxadiène. D'autres étapes, y compris les oxydations multiples du cytochrome P450, demeurent difficiles, mais les progrès récents dans l'ingénierie eucaryotique P450 dans les bactéries offrent l'espoir d'une voie biosynthétique complète.

Surmonter les défis

Malgré ces succès, il faut surmonter les obstacles importants avant que la production microbienne ne devienne courante pour la plupart des produits naturels rares.

Rendement et productivité

La viabilité industrielle exige généralement des titres de grammes par litre. De nombreuses souches ne produisent que des milligrammes.

  • L'insuffisance de l'approvisionnement en précurseurs — le métabolisme natif de l'hôte peut ne pas canaliser suffisamment de carbone dans la voie souhaitée.
  • Les enzymes limitant la vitesse — de mauvais paramètres cinétiques ou de faibles niveaux d'expression créent des goulots d'étranglement.
  • Le fardeau métabolique — le maintien des gènes et des voies hétérologues peut ralentir la croissance, réduisant ainsi la production totale.

Les approches de biologie des systèmes, y compris l'analyse des flux métaboliques et la modélisation à l'échelle du génome, aident à identifier les cibles les plus prometteuses pour l'ingénierie.

Inhibition de la toxicité et de la rétroaction du produit

De nombreux produits naturels sont antimicrobiens par conception, leur accumulation peut tuer le micro-organisme producteur.

  • Élimination in situ du produit — Utilisation de la fermentation en deux phases avec des solvants organiques ou des résines adsorbantes pour extraire le produit tel qu'il se forme.
  • Ingénierie de pompe à flux — Introduire ou sur-exprimer des protéines de transporteur qui exportent le produit hors de la cellule.
  • Compartimentalisation — Ciblage des enzymes de la voie vers les organites subcellulaires (p. ex. peroxysomes ou mitochondries) vers les intermédiaires toxiques séquestres.
  • Détournement du produit — Conversion du produit fini toxique en un dérivé moins toxique qui peut être transformé plus tard.

Découverte et affectation des sentiers

De nombreux produits naturels rares ont des voies biosynthétiques inconnues ou partiellement caractérisées. L'extraction métagénomique, l'expression hétérologue de l'ADN environnemental et l'activation de groupements de gènes silencieux dans les organismes indigènes sont des domaines de recherche actifs.

Échelle et économie de la fermentation

Le passage de la mousse à la mousse à l'échelle pilote puis aux fermenteurs industriels pose des défis comme le transfert d'oxygène, le mélange et les stratégies d'alimentation en nutriments. L'optimisation du processus pour chaque hôte microbien est essentielle. De plus, le traitement en aval – purification du produit à partir d'un bouillon de fermentation complexe – peut représenter 50 à 80 % du coût total de production.

Perspectives d'avenir

Le domaine progresse rapidement, sous l'impulsion d'innovations dans plusieurs domaines.

Apprentissage automatique et AI

Les modèles d'apprentissage automatique peuvent prédire quelles variantes d'enzymes seront les plus actives, identifier les génotypes métaboliques optimaux à partir de données de grande taille et concevoir des promoteurs synthétiques. Par exemple, l'apprentissage profond a été utilisé pour concevoir des cytochromes P450s avec une activité améliorée sur des substrats non indigènes.

Génie métabolique sans cellules

Les systèmes sans cellules, utilisant des enzymes purifiées ou des lysats bruts, contournent de nombreuses contraintes des cellules vivantes – toxicité, transport membranaire et régulation cellulaire. Ils permettent un prototypage rapide des voies et peuvent être lyophilisés pour une stabilité à long terme. Des travaux récents ont démontré une synthèse sans cellules du limone terpénoïde et de la réticuline des précurseurs opioïdes.

Biocapteurs et contrôle dynamique

Les biocapteurs à réaction métabolique, construits à partir de facteurs de transcription ou de riboswitches, permettent de surveiller en temps réel les performances de la voie. Lorsqu'ils sont couplés à des circuits génétiques, ils peuvent automatiquement ajuster l'expression enzymatique pour maintenir un flux de voie optimal. Par exemple, un biocapteur pour le malonyl-CoA intermédiaire dans E. coli a été utilisé pour augmenter dynamiquement la production d'acides gras tout en diluant les voies concurrentes.

Ingénierie de la souche automatisée

Les plates-formes robotiques qui combinent manipulation, transformation et cueillette de colonies peuvent générer des milliers de souches artificielles par semaine. Lorsqu'elles sont combinées à des tests de dépistage à haut débit (par exemple, par LC-MS ou par fluorescence), ces systèmes accélèrent considérablement le cycle d'apprentissage de conception-construction-essai.

Consortia synthétique

Au lieu d'un seul microbe pour effectuer la synthèse, les chercheurs explorent des consortiums microbiens où différentes souches ou espèces effectuent des étapes distinctes. Par exemple, un champignon peut produire un précurseur qu'une bactérie convertit au produit final. Cette approche modulaire réduit le fardeau pour un organisme unique et permet une optimisation parallèle de chaque module.

Conclusion

De l'artémisinine aux opioïdes, la capacité de programmer des cellules microbiennes pour effectuer une chimie biosynthétique complexe offre une voie durable, évolutive et potentiellement moins coûteuse vers de nombreuses molécules les plus précieuses connues. Des défis subsistent, notamment pour obtenir des rendements commerciaux et pour découvrir et élucider de nouvelles voies. Pourtant, la convergence de l'édition génétique basée sur le CRISPR, la modélisation métabolique avancée, l'apprentissage machine et l'automatisation promettent d'accélérer les progrès. À mesure que ces outils mûrissent, le goulot d'étranglement passera de à si] nous pouvons produire un composé à à quelle vitesse nous pouvons le commercialiser.