Introduction : Le défi de l'oxygène dans la culture du SMC

Leur capacité à se renouveler et à se différencier en ostéoblastes, chondriocytes et adipocytes en fait une pierre angulaire des thérapies à base de cellules. Cependant, l'expansion à grande échelle des MSC tout en préservant leurs propriétés fonctionnelles demeure un obstacle important. Parmi les nombreux paramètres de culture – composition des médias, facteurs de croissance, rigidité du substrat et nombre de passages – la tension d'oxygène se distingue particulièrement influente mais souvent négligée. La pratique courante de cultiver les MSC sous l'air ambiant (environ 21% d'oxygène) ressemble peu au microenvironnement à faible oxygène de leurs niches indigènes.

Au cours de la dernière décennie, un nombre croissant de données probantes ont démontré que l'adaptation de la tension d'oxygène à des niveaux physiologiquement pertinents – généralement de 1 à 5 % – peut améliorer considérablement l'efficacité de l'expansion et la qualité thérapeutique du SMC.

Tension physiologique de l'oxygène : la niche du SMC autochtone

In vivo, les MSC résident dans des niches périvasculaires au sein de la moelle osseuse, des tissus adipeux et d'autres organes.Ces milieux se caractérisent par des tensions d'oxygène allant de 1 à 8 %, bien en dessous des niveaux atmosphériques. Par exemple, la tension d'oxygène de la moelle osseuse est estimée entre 1 et 7 %, selon l'emplacement spécifique et la vascularisation.

Pourquoi l'oxygène atmosphérique est stressant pour les MSC

À 21 % d'oxygène, les MSC sont exposés à des conditions hyperoxiques par rapport à leur habitat naturel. Ces niveaux élevés d'oxygène augmentent la production d'espèces d'oxygène réactif (SRO) dans les mitochondries. Les SRO élevés peuvent endommager les composants cellulaires – protéines, lipides et ADN – et activer les voies de signalisation du stress. Au fil du temps, cela entraîne une sénescence réplicative, une réduction de la capacité de prolifération et un déplacement vers la différenciation ostéogénique ou adipogène, souvent au détriment de la tige.

Hypoxie comme signal physiologique

L'hypoxie légère (1 à 5 % d'oxygène) n'est pas une condition de stress, mais plutôt un signal physiologique qui déclenche des réponses adaptatives. Le médiateur central est le facteur inductif hypoxie (FHF). Sous la normoxie, HIF-1α est hydroxylé par les enzymes du domaine hydroxylase (PHD) prolyle et dégradé par la voie von Hippel-Lindau (VHL).

Les principaux objectifs du FHH qui sont pertinents pour les MSC sont notamment les suivants :

  • Facteur de croissance endothéliale ensculaire (VEGF):Promeuve l'angiogenèse et soutient la survie du SMC dans les environnements ischémiques.
  • Transporteur de glucose 1 (GLUT1) et lactate déshydrogénase A (LDHA): Déplacement du métabolisme de la phosphorylation oxydative à la glycolyse, réduisant la production de SRO.
  • CXCR4: Améliore la migration et le homogénation des tissus blessés par le SMC.
  • oct4, Sox2, et Nanog: Maintenir les marqueurs de la pluripotence et des cellules souches.

Ainsi, optimiser la tension d'oxygène est essentiellement recréer l'environnement de signalisation qui maintient les MSC dans un état de régénération, de prolifération.

Impact de la tension d'oxygène sur la prolifération du SMC

Plusieurs études ont signalé une augmentation des taux de prolifération lorsque les MSC sont cultivés sous hypoxie (1 à 5% O2) par rapport à la normoxie (21% O2). L'effet est généralement observé après plusieurs jours d'adaptation et peut entraîner une augmentation de 1,5 à 3 fois du nombre de cellules pendant la même période de culture. Fait important, la prolifération accrue n'est pas accompagnée d'une perte de capacité de différenciation ou d'un risque tumoraligène accru.

Niveaux optimaux d'oxygène pour la prolifération

Bien que l'oxygène de 1 à 5 % soit généralement bénéfique, le niveau optimal exact peut dépendre de la source tissulaire et de l'âge du donneur. Pour les MSC dérivés de la moelle osseuse (MSC-BM), l'oxygène de 2 à 5 % semble donner une prolifération maximale. Pour les MSC dérivés de l'adipose (MSC-AD), 1 à 3 % est souvent préféré.

Durée et effets de transmission

Les bénéfices de l'hypoxie sont plus prononcés lors des premiers passages (P0–P5). Une culture étendue au-delà de P10 sous hypoxie peut encore être avantageuse, mais les cellules peuvent s'adapter progressivement et montrer une réponse diminuée. De plus, passer de l'hypoxie à la normoxie (p. ex. pendant la récolte) peut provoquer une explosion de ROS; un protocole de réoxygénation progressive (montage de l'oxygène sur 2 à 4 heures) contribue à atténuer ce choc.

Préserver la stérilité et le potentiel de différenciation

L'une des principales préoccupations de l'expansion à grande échelle du SMC est la perte de polypotence, ce qui est souvent appelé la sénescence répétitive ou le choc -culture. . Hypoxie aide à maintenir un phénotype plus jeune. Les MSC cultivés sous faible oxygène montrent une expression plus élevée de SSEA-4, CD73, CD90 et CD105 (marqueurs MSC positifs) et une expression plus faible de CD34 et CD45. Ils conservent également une capacité supérieure à différencier en os, cartilage et graisse après exposition à l'hypoxie.

Il est intéressant de noter que l'hypoxie influence l'engagement de lignage. Dans certaines conditions, l'hypoxie peut favoriser la chondrogenèse et l'adipogenèse tout en supprimant l'ostéogenèse. Cependant, si elle est combinée à des facteurs d'induction appropriés, le préconditionnement hypoxique peut en fait améliorer la différenciation ostéogène en uprégulant Runx2 et Osterix.

Mécanismes de maintien de l'écaillage

  • La signalisation HIF-2α[: Bien que HIF-1α soit plus associée à l'adaptation métabolique, HIF-2α active directement oct4 et Sox2 pour maintenir la tige.
  • Modifications d'histones: L'hypoxie modifie la structure de la chromatine par l'intermédiaire des déméthylases d'histones (p. ex. JMJD1A, JMJD2B), en maintenant les gènes des cellules souches accessibles.
  • Rénovation métabolique: La glycolyse produit moins de ROS, qui protège le génome et préserve l'activité de la télomérase.

Approches pratiques pour contrôler la tension d'oxygène

Pour mettre en œuvre la culture hypoxique dans un laboratoire ou un cadre de production, il existe plusieurs options d'équipement, chacune comportant des compromis en termes de coûts, de précision et d'évolutivité.

Incubateurs hypoxiques

Des incubateurs hypoxiques dédiés (p. ex. de sociétés comme Baker, Thermo Fisher ou Panasonic) injectent de l'azote ou un mélange azote/CO2 pour déplacer l'oxygène. Ils peuvent maintenir des niveaux d'oxygène stables de 0,1% à 20% avec une haute précision (±0,1% O2). Ils sont idéaux pour la recherche à petite échelle, mais peuvent être coûteux et peuvent nécessiter un calibrage fréquent et une gestion des bouteilles de gaz.

Chambres à gaz et chambres d'incubation modulaires

Pour les laboratoires dont le budget est établi, des chambres modulaires (p. ex., Billups-Rothenberg) peuvent être placées dans un incubateur standard de CO2. La chambre est rincée avec un gaz prémélangé (p. ex., 5% O2, 5% CO2, balance N2) et scellée. Cette approche est plus simple mais moins stable; les niveaux d'oxygène peuvent dériver lorsque la chambre est ouverte pour des changements de médias ou pour l'échantillonnage.

Bioréacteurs avec contrôle de l'oxygène

Pour l'expansion à l'échelle clinique (milliards de cellules), les bioréacteurs tels que le Quantum® (Terumo BCT) ou les bioréacteurs à roue verticale (PBS Biotech) offrent un contrôle intégré de l'oxygène par aération de l'espace de tête ou par séparation directe. Ces systèmes mesurent l'oxygène dissous (dO2) en temps réel à l'aide de capteurs optiques et ajustent le mélange gazeux en conséquence.

Considérations relatives au protocole pour la culture hypoxique du SMC

La réussite avec l'hypoxie nécessite une attention particulière aux détails. Les lignes directrices suivantes peuvent aider à assurer la reproductibilité et des résultats optimaux.

Acclimation et adaptation

Une diminution progressive (p. ex., une réduction progressive de 24 à 48 heures) peut améliorer l'adaptation. On peut aussi étendre les cellules sous la normoxie pour le premier passage, puis les transférer dans l'hypoxie pour les passages suivants. Ceci empêche une réponse de choc qui pourrait tuer une partie de la culture.

Médias et suppléments

Le métabolisme hypoxique repose fortement sur la glycolyse. Les milieux doivent contenir du glucose adéquat (1–4,5 g/L) et être tamponnés pour augmenter la production de lactate. Certains chercheurs complètent avec des antioxydants comme la vitamine C ou la N-acétylcystéine pour réduire davantage le stress oxydatif, mais ceux-ci peuvent interférer avec l'hypoxie signalant et doivent être utilisés avec prudence. Le sérum bovin foetal (SBF) peut également affecter la réponse parce que le sérum contient des quantités variables de facteurs de croissance et d'hormones; les formulations sans sérum ou sans xénoxéno sont préférées pour les applications cliniques.

Surveillance de l'oxygène

Le simple fait de placer l'incubateur à 5 % O2 ne garantit pas que les cellules subissent ce niveau. Les capteurs d'oxygène placés à l'intérieur du récipient de culture ou à l'entrée du gaz mesurent avec précision ce que les cellules voient.

Défis et obstacles

Malgré ses avantages, la culture hypoxique n'est pas sans défis. Les gradients d'oxygène à l'intérieur du vaisseau de culture peuvent se développer, en particulier en culture statique. À forte confluence cellulaire, le taux de consommation d'oxygène peut dépasser le taux de diffusion, créant des microenvironnements d'hypoxie sévère (près de 0 %) au fond du puits ou du flacon.

La réponse variable des MSC de différents donneurs est également un problème. L'âge du donneur, l'état de santé et la source tissulaire influencent le niveau optimal d'oxygène.

Enfin, les organismes de réglementation exigent souvent des conditions de culture bien définies pour les produits de thérapie cellulaire. L'hypoxie doit être documentée comme paramètre critique du processus, avec des capteurs d'oxygène validés et des alarmes.

Études de cas et faits saillants de la recherche

Plusieurs groupes ont réussi à traduire l'expansion hypoxique du SMC en production clinique.Par exemple, une étude de 2020 réalisée par Czapla et al. a démontré que les MSC ont augmenté sous 2 % d'oxygène dans un bioréacteur à roue verticale, conservant une fonction immunosuppressive plus élevée et produisant 50 % plus de vésicules extracellulaires que les cellules cultivées à 21 % d'oxygène. De même, Bader et al. (2021) a montré que le préconditionnement hypoxique a amélioré la survie et l'engreffement du SMC dans un modèle d'infarctus du myocarde du rat.

Autre cas notable : un procédé de fabrication conforme aux BPF pour les MSC dérivés de la moelle osseuse a utilisé 5 % d'oxygène pour les trois premiers passages, puis a été remplacé par la normoxia pour l'étape finale de l'expansion. Cette approche hybride a équilibré les avantages de l'hypoxie avec la facilité de culture terminale normoxique, donnant des cellules à haute puissance pour un essai clinique de phase I dans la maladie greffon-contre-hôte.

Orientations futures : Contrôle intelligent de l'oxygène et rétroaction en temps réel

Les capteurs optiques intégrés dans le logiciel de culture peuvent transmettre les données dO2 à une boucle de rétroaction qui ajuste le débit de gaz. Les algorithmes d'apprentissage automatique peuvent prédire des profils d'oxygène optimaux basés sur la densité cellulaire, l'activité métabolique et le résultat phénotypique souhaité.

De plus, combiner l'hypoxie avec d'autres indices microenvironnementaux, comme la contrainte de cisaillement de perfusion, la rigidité du substrat et les échafaudages 3D, pourrait créer un ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Enfin, le rôle de la tension d'oxygène dans la cryopréservation et la récupération après le dégel est une zone émergente. La culture hypoxique prégelée pourrait améliorer la viabilité et le fonctionnement des cellules après le dégel, ce qui est essentiel pour les thérapies cellulaires hors-sol.

Conclusion : Faire de la tension d'oxygène un paramètre standard

L'optimisation de la tension d'oxygène n'est pas un luxe, mais une nécessité pour quiconque s'intéresse sérieusement à l'expansion des cellules souches mésenchymiques. En alignant les conditions de culture avec le microenvironnement naturel, les chercheurs peuvent obtenir des rendements plus élevés, une meilleure tige et des résultats thérapeutiques améliorés.

Nous recommandons fortement que chaque laboratoire qui utilise actuellement 21 % d'oxygène pour la culture du SMC réévalue cette pratique. Commencez par une expérience pilote simple : comparez la prolifération et la différenciation à 5 % et 21 % d'oxygène sur deux passages. Les résultats peuvent conduire à un changement permanent dans votre protocole. Pour plus de détails, consultez des ressources telles que les lignes directrices de la Société internationale de recherche sur les cellules souches ou la revue complète par Ejtehadifar et al. (2020) sur les effets de l'oxygène sur les cellules souches.