Au cours de la dernière décennie, le domaine a progressé rapidement, donnant des journalistes plus brillants, plus stables et plus spécifiques qui permettent aux chercheurs de poser des questions, et de répondre à des questions qui étaient auparavant hors de portée. En intégrant ces journalistes dans le génome cellulaire, les chercheurs peuvent suivre l'expression génétique, la localisation des protéines, l'activité enzymatique et la dynamique de signalisation avec une perturbation minimale à la cellule. Cet article fournit un examen faisant autorité des dernières avancées dans les journalistes génétiquement codés pour les études de culture cellulaire, couvrant leurs principes de conception, les améliorations technologiques, les applications et les orientations futures.

Que sont les journalistes encodés génétiquement?

Les reporters génétiquement codés sont des molécules protéiques qui produisent un signal mesurable, généralement la fluorescence, la bioluminescence ou un changement colorimétrique, lorsqu'ils sont exprimés dans des cellules vivantes. Le gène du reporter est introduit dans le génome cellulaire (ou maintenu comme épisome stable) et est souvent fusionné à un gène d'intérêt ou placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique.

Le concept date de la découverte et du clonage de protéines fluorescentes vertes (GFP) de la méduse Aequorea victoria au début des années 1990, travail qui a valu à Osamu Shimomura, Martin Camumie et Roger Y. Tsien le prix Nobel de chimie 2008. Depuis, la boîte à outils s'est étendue de façon spectaculaire.

  • Protéines fluorescentes (FP) telles que GFP, mCherry et mNeonGreen qui émettent de la lumière lors de l'excitation.
  • Les reporters bioluminescentes comme la luciférase de la luciférase de la luciférase de la luciférase et le nanoLuc qui produisent de la lumière par une réaction de substrat enzymatique sans éclairage externe.
  • Les boosensors qui changent leur fluorescence ou leur bioluminescence en réponse à des molécules spécifiques (p. ex. calcium, ATP, pH) ou des modifications post-traductionnelles (p. ex. phosphorylation).
  • Les reporters split qui se sont réassemblés en protéines fonctionnelles seulement lorsque deux partenaires interagissent se rapprochent de près (utilisés pour les études d'interaction protéinique).

En culture cellulaire, ces outils permettent aux chercheurs de visualiser des processus dynamiques à haute résolution spatiotemporelle. Parce que les reporters sont génétiquement encodés, ils peuvent être exprimés de façon stable dans des lignées cellulaires ou introduits de façon transitoire, fournissant une fenêtre non invasive dans la cellule vivante.

Progrès technologiques récents

Les progrès réalisés dans le domaine de l'ingénierie des protéines, de l'évolution dirigée et de la biologie synthétique ont considérablement amélioré les performances des reporters génétiquement codés. Les principaux domaines de progrès comprennent des protéines fluorescentes plus brillantes et plus phototables, de nouvelles classes de biocapteurs à cinétique plus rapide et l'expansion de la palette spectrale pour l'imagerie multiplexée.

Protéines fluorescentes améliorées

Le champ des protéines fluorescentes a dépassé de loin le GFP original. Les variantes modernes offrent des propriétés optimisées adaptées à des applications spécifiques.

  • Les émissions plus grandes et les rendements quantiques plus élevés: Les protéines telles que mNeonGreen (rendement quantique à 91 %) et mScarlet (rendement quantique à 70 %) fournissent des signaux nettement plus forts que leurs prédécesseurs, permettant la détection de cibles à faible abondance et de temps d'observation plus long.
  • Phototabilité améliorée:[ L'évolution dirigée a produit des variantes qui résistent au blanchiment de photo même sous un éclairage intense, critique pour les techniques d'imagerie et de super-résolution du temps.
  • Palette de couleurs élargie: Des protéines fluorescentes à grande profondeur (mTagBFP2) aux protéines rouge lointain (miRFP670, mCardinal), les chercheurs ont maintenant accès à une large gamme de spectres.
  • Les formes monomères et dimériques: Les variantes monomères (par exemple, mEGFP, mCherry) permettent de prévenir l'agrégation artéfactaire et sont essentielles pour les protéines de fusion.

Ces améliorations ont permis d'imaginer simultanément plusieurs structures cellulaires, de suivre les molécules uniques dans les cellules vivantes et d'effectuer des analyses quantitatives avec confiance.

Biocapteurs encodés génétiquement

Contrairement aux étiquettes fluorescentes simples, les biocapteurs changent leurs propriétés optiques en réponse à un événement biologique, fournissant des lectures fonctionnelles.

  • Indicateurs de calcium: La famille GCaMP (GCaMP6, jGCaMP8) et son dérivé rétrogradé sont largement utilisés pour surveiller l'activité neuronale, la contraction des cellules cardiaques et d'autres processus dépendants du calcium. Les dernières versions (jGCaMP8s, jGCaMP8f) ont amélioré la cinétique et le rapport signal-bruit, permettant de détecter les potentiels d'action uniques dans les neurones cultivés.
  • Les capteurs de metabolite: Les indicateurs fluorescents pour le glucose (FLII12Pglu-700μγ6), l'ATP (QUEEN, PercevalHR) et le NADH/NAD+ (Peredox) permettent de suivre en temps réel les états métaboliques.
  • Les reporters de voie de signalisation: Des reporters comme le ERK‐KTR (reporter de translocation de la kinase) et le reporter d'activité de la kinase A (AKAR) basé sur FRET permettent de mesurer l'activité de la kinase.
  • Les indicateurs de tension encodés génétiquement (GEVIs) tels que ASAP3 et Archon1 permettent de lire à l'échelle milliseconde le potentiel membranaire dans les cellules excitables, en complément des techniques traditionnelles de pince à patch.
  • pH et capteurs redox:[ Des capteurs comme la pHluorine (pH) et HyPer (H2O2) permettent une quantification précise des environnements cellulaires.

La tendance du développement du biocapteur est vers une cinétique plus rapide, une plage dynamique plus élevée et une compatibilité multicolore, permettant ainsi une surveillance simultanée de plusieurs cibles dans la même cellule.

Rédacteurs bioluminescents et BRET

Les reporters bioluminescents, qui ne nécessitent pas d'excitation externe, offrent une alternative intéressante à la fluorescence pour des études à long terme où la phototoxicité ou l'autofluorescence de fond est préoccupante. La luciférase de la crevette de haute mer Oplophorus gracilirostris[, NanoLuc, est exceptionnellement lumineuse et petite (19 kDa). Lorsqu'elle est jumelée à son substrat optimisé, la furimazine, NanoLuc produit une lueur qui peut être maintenue pendant des heures. Les variantes BRET (transfert d'énergie par résonance de la bioluminescence) combinent la luciférase et les protéines fluorescentes pour créer des capteurs ratiométriques, tels que l'indicateur Ca2+ Nluc‐GCaMP (hybride de «lucy‐flower» ou le capteur CAMP TEpacVV.

Applications dans les études de culture cellulaire

Les journalistes encodés génétiquement sont devenus des outils omniprésents dans la recherche sur la culture cellulaire, permettant de mieux comprendre la biologie fondamentale et d'accélérer la découverte de médicaments.

Surveillance en temps réel de l'expression génique

En plaçant un gène de reporter sous le contrôle d'un promoteur d'intérêt, les scientifiques peuvent mesurer l'activité transcriptionnelle dans les cellules vivantes au fil du temps. Par exemple, l'utilisation de protéines fluorescentes déstabilisées (p. ex. d2EGFP) avec de courtes demi-vies permet au signal de reporter de s'élever et de diminuer rapidement en réponse à des stimuli changeants, fournissant une lecture fidèle de l'activité du promoteur.

Dépistage à teneur élevée et découverte de médicaments

Par exemple, une ligne cellulaire exprimant un reporter de translocation nucléaire (p. ex. NF‐κB‐GFP) peut être utilisée pour détecter les composés anti-inflammatoires. De même, les biocapteurs de l'apoptose (p. ex. les capteurs caspase‐3 FRET) ou la phase du cycle cellulaire (p. ex. le système Fucci) fournissent des lectures fonctionnelles dans les tests d'imagerie en direct des cellules. Ces journalistes ont amélioré de façon significative la puissance prédictive des écrans in vitro, réduisant ainsi les faux positifs dans les études sur les animaux en aval. (Pour plus de détails, voir l'examen sur le HCS dans la découverte de médicaments par Korn et ses collègues.)

Interactions protéiques-protéines et dynamique de localisation

Les protéines à fractionnement fluorescent (p. ex., splitGFP, splitmCherry) et la complémentation bioluminescente (NanoBit) permettent aux chercheurs de détecter les interactions protéiques dans les cellules vivantes. Ces reporters sont inestimables pour cartographier les réseaux de signalisation et valider les cibles médicamenteuses potentielles.

Analyse du flux métabolique

Par exemple, PercevalHR (un capteur du rapport ATP:ADP) et le capteur NADH Peredox ont été utilisés pour étudier comment les cellules cancéreuses refilent leur métabolisme (l'effet de Warburg) et comment les mitochondries réagissent aux toxines. Dans le développement de médicaments, ces reporters peuvent signaler des composés qui perturbent l'énergie cellulaire, fournissant des signaux de sécurité précoces.

Cellules souches et biologie du développement

Les lignes cellulaires des reporters sont des outils essentiels pour étudier la différenciation. Par exemple, les cellules souches embryonnaires humaines exprimant un reporter GFP sous le promoteur OCT4 peuvent être utilisées pour surveiller le statut de pluripotence. Les reporters inductibles entraînés par des promoteurs spécifiques à la lignée (p. ex. SOX17 pour endoderm) permettent le suivi en temps réel des trajectoires de différenciation.

Défis et limites actuelles

Malgré leur pouvoir, les journalistes génétiquement codés ont des limites que les chercheurs doivent considérer.

  • Phototoxicité et photoblanchiment:[ Même avec des protéines fluorescentes améliorées, l'imagerie prolongée peut endommager les cellules. L'utilisation de FP plus brillant réduit l'intensité d'éclairage requise, mais la phototoxicité demeure une préoccupation pour les études à long terme sur les périodes.
  • Effets envahissants des étiquettes de fusion: La fusion d'un reporter à une protéine d'intérêt peut modifier sa fonction, sa localisation ou sa stabilité.
  • Temps de maturation: Les protéines fluorescentes nécessitent du temps pour se plier et former un chromophore. Pour les événements rapides (sous-seconde), les reporters à maturation plus rapide (p. ex., mNeonGreen) sont préférés, mais certains reporters ont encore des retards qui peuvent manquer de dynamique rapide.
  • La surexpression des reporters peut entraîner la formation d'agrégats ou un fardeau métabolique. Des lignées cellulaires stables avec une intégration à faible copie ou des promoteurs inductifs aident à atténuer ces problèmes.
  • Autofluorescence de fond: Les médias de culture et les composants cellulaires (p. ex., les flavines) peuvent produire une autofluorescence qui interfère avec les protéines fluorescentes vertes/rouges.

Pour une analyse approfondie des meilleures pratiques, veuillez consulter ].

Critères de sélection pour choisir un reporter

Avec autant de journalistes disponibles, choisir le bon peut être redoutable.

  • Choisissez un reporter qui correspond à votre microscope.][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:]][FLT:][FLT:]][FLT:]][FLT:]][FLT:][FLT:]][FLT:][FLT:]][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:][FLT:]][FLT:][FLT:]][FLT:][FLT:]][FLT:]][FLT:][FLT:][FLT:][Filtres][Filtres][Filtres]
  • Brightness et photostability:[ Pour l'imagerie quantitative, sélectionnez des reporters à haut rendement quantique et à faible taux de photoblanchiment.
  • Kinétiques: Pour les processus rapides (p. ex., transitoires calciques), utilisez des reporters avec des taux d'on‐ et de hors‐taux rapides.
  • La plage dynamique: Pour les biocapteurs, une plage dynamique plus grande améliore la sensibilité.
  • Maturation et dégradation:[ Assurez-vous que le reporter mûrit assez rapidement pour votre application et, au besoin, a une demi-vie courte pour suivre les signaux décroissants.
  • Cadre cellulaire:[ Certains reporters travaillent mieux dans certains types de cellules (p. ex., les FP à infrarouge proche nécessitent de la biliverdin, qui peut devoir être complétée en culture).

La ressource FPbase fournit une base de données consultable sur les propriétés protéiques fluorescentes qui peuvent aider à la prise de décisions.

Orientations futures

La prochaine génération de journalistes promet des capacités encore plus grandes. Plusieurs tendances émergentes façonnent le terrain :

Reporters quasi infrarouges et optogénétiques

Des protéines fluorescentes presque infrarouges (p. ex., série miRFP, iRFP) permettent l'imagerie profonde par les tissus et réduisent les dommages cellulaires. Des reporters optogénétiques qui combinent des domaines de détection de la lumière et des domaines de sortie sont également en cours de développement, permettant l'expression de gènes contrôlés par la lumière ou la localisation de protéines dans le cadre de la même expérience.

Capteurs multiplexés

Les progrès réalisés dans les algorithmes de désintégration et de segmentation spectrale permettent d'utiliser simultanément cinq reporters ou plus. Par exemple, une cellule unique pourrait contenir des capteurs pour le calcium, le pH, la tension et une activité kinase, offrant une vue multiparamètre de l'état cellulaire.

Intégration de l'apprentissage automatique

Les modèles d'apprentissage automatique formés à des ensembles de données d'imagerie volumineuses peuvent extraire des informations provenant de signaux de reporters qui seraient invisibles à l'œil humain. Par exemple, l'apprentissage profond peut prédire des trajectoires monocellulaires à partir de la dynamique des premiers reporters ou classer des états cellulaires en fonction de variations subtiles des modèles d'expression des reporters.

Dans Vivo et la Compatibilité Culture 3D

Les journalistes sont conçus pour fonctionner dans des environnements plus difficiles, comme les organoides et les sphéroïdes 3D, où les gradients d'oxygène et la diffusion de lumière posent des problèmes supplémentaires.

Amélioration des systèmes Luciferase‐Ligand

De nouvelles paires de substrats de la luciférase avec une émission plus vive et une meilleure pénétration des tissus sont en cours de développement. Les reporters auto-illuciférase-FP qui combinent les avantages de la fluorescence et de la bioluminescence sont un domaine de recherche prometteur.

Conclusion

Les progrès récents en génie des protéines ont permis de produire des outils plus brillants, plus stables et plus polyvalents, permettant aux chercheurs de surveiller les flux ioniques, les états métaboliques, les voies de signalisation et l'expression des gènes avec une précision sans précédent. Bien que des défis subsistent — la phototoxicité, les temps de maturation et les artefacts potentiels —, un design expérimental soigné et le choix judicieux des journalistes peuvent surmonter ces obstacles.

Pour les chercheurs qui sont nouveaux sur le terrain, en commençant par des journalistes bien validés provenant de dépôts fiables (comme Addgene[) et en consultant des revues complètes, comme celle publiée dans Méthodes de nature[ (Rodriguez et al., 2017), peuvent accélérer le chemin vers des expériences réussies. La boîte à outils continuera seulement de croître, ce qui en fera un moment passionnant pour explorer le monde dynamique des cellules vivantes. (Pour un aperçu de l'évolution des protéines fluorescentes, voir l'article de Chudakov et al. .