Stratégies bioréacteurs pour le développement de tissus pancréatiques fonctionnels pour le traitement du diabète

Types de bioréacteurs utilisés dans la recherche pancréatique

Bioréacteurs de perfusion

Dans ces systèmes, le milieu de culture est continuellement circulé à travers un lit de cellules ou d'échafaudages tissulaires, fournissant un flux constant de nutriments et d'oxygène. La capacité de contrôler indépendamment le débit, la pression partielle d'oxygène et la composition moyenne rend les bioréacteurs de perfusion idéals pour les protocoles de différenciation complexes et multi-étapes nécessaires pour générer des cellules SC-beta. Des systèmes comme le Système d'expansion des cellules quantiques et des colonnes de perfusion construites sur mesure soutiennent la culture de millions d'équivalents îlots dans un environnement fermé et conforme aux GMP.

Systèmes microfluidiques d'organes sur un chip

Ces dispositifs contiennent des microcanaux qui imitent la microvasculature du pancréas, permettant aux chercheurs d'étudier la fonction des îlots dans des conditions de débit physiologiquement pertinentes. Les plates-formes d'organes sur puce permettent de surveiller en temps réel la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose (SIG), la consommation d'oxygène et le flux de calcium provenant de petits nombres d'îlots. Ces systèmes sont particulièrement utiles pour le dépistage des médicaments, les essais de toxicité et l'optimisation des protocoles de différenciation avant de les mettre à l'échelle de plus grands formats de bioréacteurs.

Bioréacteurs à fibre creuse

Les cellules sont ensemencées dans l'espace extra-capillulaire, tandis que le milieu de culture coule à travers la lumen des fibres. La membrane de fibre creuse agit comme un lit capillaire artificiel, fournissant un transfert de masse efficace tout en protégeant les cellules contre le stress de cisaillement direct. Ce format imite étroitement le microenvironnement îlot indigène où les cellules bêta sont entourées d'un réseau dense de capillaires. Les systèmes de fibres Hollow ont été adoptés par des entreprises comme Vertis (anciennement Beta2) pour leurs dispositifs de thérapie cellulaire implantables, où le bioréacteur est utilisé pour préconditionner les cellules avant l'implantation.

Bioréacteurs de vaisseaux à parois tournantes

Les bioréacteurs à parois tournantes (RWV) développés par la NASA créent un environnement de microgravité simulée à faible cisaillement en tournant le vaisseau de culture autour d'un axe horizontal. Cette configuration favorise la formation d'agrégats cellulaires tridimensionnels de taille uniforme et de viabilité accrue.

Stratégies basées sur les échafaudages pour l'architecture tissulaire

Échafaudages biomimétiques pour l'organisation cellulaire

Pour reproduire cet environnement, les chercheurs utilisent des approches basées sur l'échafaudage au sein des bioréacteurs pour guider l'organisation des cellules endocriniennes dérivées des cellules souches dans des structures semblables à des îlots, avec une architecture spatiale appropriée.

Hydrogels naturels

Les hydrogels dérivés de composants naturels de l'ECM, dont le collagène I, la laminine, la fibronectine et l'acide hyaluronique, sont largement utilisés pour l'ingénierie des tissus pancréatiques. Ces matériaux fournissent des signaux biochimiques intrinsèques qui favorisent la survie et la fonction des cellules bêta. L'alginate, dérivé des algues brunes, est particulièrement attrayant pour l'encapsulation des îlots en raison de sa biocompatibilité et de sa capacité à former des hydrogels dans des conditions légères.

Échafaudages synthétiques et hybrides

Les polymères synthétiques tels que l'acide poly(acide lactique-coglycolique) (PLGA) et le poly(éthylène glycol) (PEG) offrent des propriétés mécaniques et des taux de dégradation qui peuvent être fonctionnels avec des peptides adhésifs (séquences de GRD) et des facteurs de croissance pour le comportement cellulaire direct.

Matrices pancréatiques décellulisées

La décellulation des organes entiers consiste à retirer le contenu cellulaire d'un pancréas donneur tout en préservant l'architecture indigène de la MCE, y compris le réseau vasculaire et les microenvironnements des îlots. L'échafaudage acellulaire qui en résulte conserve les propriétés mécaniques naturelles et la composition biochimique du pancréas. Lorsqu'il est ensemencé avec des cellules de progéniteurs pancréatiques dérivées de cellules souches dans un bioréacteur de perfusion, ces échafaudages supportent la repeuplement de niches d'îlots et la formation de tissus endocriniens fonctionnels avec des canaux vasculaires intacts.

Bioimpression 3D de constructions pancréatiques

Les technologies de fabrication additive permettent de déposer avec précision des cellules et des biomatériaux pour construire des tissus pancréatiques vasculaires avec géométrie contrôlée. La bioimpression permet la co-impression de cellules d'îlots avec des types de cellules supportant comme les cellules endothéliales et les cellules stromales mésenchymales pour améliorer la vascularisation et l'immunomoulation.

Differenciation dirigée des cellules souches dans les bioréacteurs

Le Plan de Développement

La différenciation des cellules souches pluripotentes humaines (CPSh) en cellules bêta fonctionnelles récapitule les étapes clés du développement embryonnaire pancréatique. Les protocoles historiques établis par le laboratoire Melton de l'Université Harvard et le laboratoire Kieffer de l'Université de la Colombie-Britannique ont défini un processus en plusieurs étapes qui prend environ 30 à 45 jours.

1. Induction définitive de l'endoderme : Utilisant des concentrations élevées d'activine A et de Wnt3a.
2. Formation de tube de Gut primaire:[ avec poursuite de l'activation A signalant plus KGF ou FGF7.
3. Spécification de l'arrière-pays : Utilisation d'inhibiteurs de la voie de l'acide rétinoïque et de l'hérisson sonique.
4. Endoderme pancréatique Engagement:[ Activation de l'expression PDX1 et NKX6-1.
5. Production de précurseurs endocriniens: Neurogénine-3 (NGN3) à régulation ascendante.
6. Maturation cellulaire de la bêta: Acquisition d'une sécrétion d'insuline stimulée par le glucose.

Optimisation du bioréacteur pour la fabrication à échelle réduite

La traduction de ces protocoles statiques de différenciation bidimensionnels à la fabrication évolutive de qualité clinique nécessite une adaptation soigneuse pour les bioréacteurs de suspension. Les cellules souches sont cultivées en agrégats dans des bioréacteurs à cuves agitées ou à roues verticales, où l'agitation maintient une taille uniforme des agrégats et empêche la sédimentation.

Les principales optimisations pour la différenciation fondée sur le bioréacteur sont les suivantes :

• Agrégat de réglage de la taille : La densité d'inoculation et la vitesse d'agitation sont ajustées pour maintenir les diamètres agrégés en dessous de 200µm pour assurer une diffusion adéquate de l'oxygène.
• Régimes d'alimentation dynamique:[ La perfusion continue permet l'élimination progressive des déchets et la reconstitution des nutriments, évitant les concentrations maximales toxiques associées à l'alimentation en bolus.
• Microenvironnement Conditionnement:[ La production endogène de MCE par des cellules de différenciation crée un échafaudage à partir de cellules qui soutient l'engagement endocrinien. Les bioréacteurs fournissent l'uniformité spatiale nécessaire pour une déposition uniforme de MCE sur de grands volumes.

Génie génétique pour une fonctionnalité améliorée

La modification du gène CRISPR-Cas9 a été utilisée pour concevoir des lignées de cellules souches qui produisent des cellules de la protéine SC-bêta hypoimmunogènes. La perturbation ciblée du gène bêta-2 de la microglobuline (B2M) élimine l'expression de surface cellulaire du complexe majeur d'histocompatibilité I (MHC-I), empêchant la reconnaissance par les cellules T cytotoxiques CD8+.

Réponse à la réponse immunitaire

Immunoisolation par encapsulation

Même avec les cellules autologues ou hypoimmunogènes, l'environnement auto-immun d'un patient avec T1D peut détruire les cellules bêta transplantées. Les stratégies d'immuno-industrialisation séparent physiquement les cellules donneurs du système immunitaire hôte en utilisant des membranes semi-perméables qui permettent le passage de l'oxygène, du glucose et de l'insuline tout en bloquant les cellules immunitaires et les anticorps.

Microencapsulation

La microencapsulation consiste à enfermer des îlots individuels ou de petites grappes cellulaires dans des billes hydrogel biocompatibles, généralement alginées. Ces billes sont produites à l'aide de générateurs de gouttelettes puis cultivées en bioréacteurs pour assurer la viabilité avant l'implantation. Le rapport surface-volume élevé des microcapsules facilite l'échange efficace de nutriments et d'oxygène.

Dispositifs de macroencapsulation

Les dispositifs de macrocapsulation tels que le système Encaptra (anciennement ViaCyte) et le dispositif TheraCyte contiennent un grand nombre de cellules dans une poche plane plane scellée avec une membrane semi-perméable. Ces dispositifs sont ensemencés avec des précurseurs de cellules SC-bêta et mûris dans des bioréacteurs avant l'implantation sous-cutanée.

Défis sur la voie de la traduction clinique

Vascularisation et approvisionnement en oxygène

Le défi biologique le plus important auquel le champ doit faire face est d'assurer un approvisionnement adéquat en oxygène des îlots transplantés. L'îlot indigène est fortement vasculaire, chaque cellule bêta étant de 1 à 2 cellules de la cellule endothéliale. Les dispositifs implantés reposent sur la diffusion passive d'oxygène à partir des tissus environnants, ce qui limite l'épaisseur de l'appareil à environ 200µm. Plusieurs stratégies sont mises en oeuvre pour remédier à cette limitation, notamment la prévascularisation du site de l'implant, l'incorporation de biomatériaux générateurs d'oxygène et l'ingénierie des réseaux microvasculaires dans l'échafaudage à l'aide de cellules endothéliales co-culturenées.

Échelle et cohérence de la fabrication

La transition des bioréacteurs à l'échelle du laboratoire (100 mL à 5 L) à la fabrication à l'échelle clinique nécessite des processus robustes qui produisent constamment des rendements élevés de cellules SC-bêta fonctionnelles. La variabilité de lots à lots dans les facteurs de croissance, les protéines ECM et d'autres réactifs demeure une source importante d'incohérence du processus.

Stabilité fonctionnelle à long terme

Les cellules SC-bêta produites dans des bioréacteurs présentent souvent une fonctionnalité immature par rapport aux îlots humains primaires, avec une sécrétion d'insuline en première phase émoussée et une libération d'insuline basale élevée. La maturation post-transplantation in vivo a été observée lors des essais cliniques, mais les facteurs qui ont motivé cette maturation demeurent incomplets.

Orientations futures et perspectives cliniques

Fabrication automatisée de boucles fermées

L'avenir de l'ingénierie des tissus pancréatiques réside dans des systèmes bioréacteurs en boucle fermée entièrement automatisés qui intègrent des capteurs en temps réel pour le glucose, l'oxygène, le lactate et le pH avec des algorithmes d'apprentissage automatique pour optimiser les conditions de culture.

Systèmes hybrides implantables

Le système de poche cellulaire de Sernova est un dispositif de macro-encapsulation qui est implanté par voie sous-cutanée et permet de vasculariser avant d'être chargé d'îlots. L'environnement prévascularisé crée un bioréacteur in vivo qui soutient la survie et la fonction des îlots à long terme. Les essais cliniques du Pouch cellulaire en association avec les îlots donneurs ont montré des résultats prometteurs, les patients obtenant l'indépendance de l'insuline.

Paysage réglementaire et commercial

Le domaine est entré dans une phase passionnante avec plusieurs entreprises qui ont avancé des candidats dans des essais cliniques. Vertex Pharmaceuticals a acquis ViaCyte et développe actuellement des cellules de bêta-SC allogéniques avec immunosuppression et VX-264 (cellules de bêta-SC encapsulées dans un dispositif de macroencapsulation). CRISPR Therapeutics développe VCTX210, une thérapie de cellules de bêta-SC hypoimmunogènes, conçue par les gènes.

Conclusion

Les stratégies basées sur les bioréacteurs ont transformé le paysage de l'ingénierie des tissus pancréatiques en fournissant les environnements contrôlés et évolutifs nécessaires pour produire des tissus fonctionnels produisant de l'insuline à partir de sources de cellules souches renouvelables. L'intégration de la conception avancée des bioréacteurs avec la biologie du développement, le génie génétique et la science des biomatériaux permet de surmonter les défis techniques qui ont toujours limité le champ.

Les références externes pour la lecture ultérieure comprennent les données des essais cliniques pour VX-880 à ClinicalTrials.gov, le protocole de différenciation fondamentale publié dans Cell (Pagliuca et al., 2014) et la recherche modifiée d'immuno-isolation d'alginate des laboratoires Anderson et Langer au MIT.