L'importance croissante de la transformation en aval dans les produits biologiques à base végétale

En tirant parti des mécanismes de synthèse des protéines naturelles des plantes comme le tabac (Nicotiana benthamiana), le riz et l'algue à tête de canard, les fabricants peuvent éviter les coûts élevés en capital, les milieux de culture complexes et les risques de contamination associés à la culture cellulaire des mammifères. Toutefois, la viabilité économique et réglementaire des produits pharmaceutiques fabriqués par des plantes dépend d'un traitement efficace en aval (DSP). Les étapes de récupération et de purification peuvent représenter de 50 à 80 % des coûts de production totaux.

Cet article explore les innovations clés qui ont été apportées au traitement en aval des produits biologiques végétaux, depuis les nouvelles techniques d'extraction jusqu'à l'automatisation, la chromatographie avancée, l'intégration des procédés et l'ingénierie verte.

Progrès dans les techniques d'extraction

La première étape de l'extraction de la protéine cible de la biomasse végétale est un défi unique : les cellules végétales contiennent des parois cellulaires rigides, des niveaux élevés de protéases, des composés phénoliques et d'autres métabolites secondaires qui peuvent dégrader ou modifier le produit. Les méthodes traditionnelles d'extraction, comme le pressage mécanique, l'homogénéisation et le lessivage par tampon, souffrent souvent de faibles rendements, de contraintes excessives de cisaillement et de co-extraction d'impuretés.

Extraction aqueuse en deux phases (ATPE)

L'extraction en deux phases aqueuse a acquis une traction pour les systèmes à base végétale.En utilisant deux phases immiscibles à base d'eau (p. ex., polyéthylèneglycol et systèmes à sels ou à polymères/polymères), l'ATPE divise la protéine cible en une phase, tandis que la plupart des contaminants restent dans l'autre.Cette méthode légère et non dénaturée peut être appliquée directement aux extraits de plantes homogénéisés, combinant clarification et purification précoce en une seule étape.

Extraction de fluide supercritique

L'extraction supercritique du dioxyde de carbone (scCO2) offre une alternative écologique aux solvants organiques pour récupérer les produits biologiques lipophiles ou pour dégraisser le matériel végétal avant l'extraction aqueuse. En ajustant la pression et la température, le scCO2 peut être accordé pour extraire sélectivement les lipides, les chlorophylles et d'autres impuretés non polaires, laissant la protéine cible intacte.

Extraction liquide assistée par micro-ondes et sous pression

L'extraction assistée par micro-ondes (MAE) et l'extraction sous pression de liquides (PLE) utilisent un chauffage contrôlé et une pression pour perturber rapidement les parois des cellules végétales.Ces méthodes réduisent le temps d'extraction d'heures à minutes et peuvent améliorer la récupération de protéines à partir de tissus récalcitrants tels que les graines ou les racines.

Automatisation et optimisation des processus

Le traitement en aval dans la biofabrication a toujours été axé sur les lots, avec une intervention manuelle pour l'emballage des colonnes, la préparation des tampons et la manipulation des échantillons. L'industrie des produits biologiques à base d'usine adopte rapidement l'automatisation pour accroître le débit, la reproductibilité et la conformité aux bonnes pratiques de fabrication actuelles (BPFC).

Manipulation robotisée des liquides et cellules de travail intégrées

Les gestionnaires de liquides automatisés peuvent exécuter simultanément des protocoles de conception d'essais (DoE) sur plusieurs types de résines, conditions tampons et débits, générant des fenêtres d'exploitation robustes en jours plutôt que semaines. À l'échelle de la fabrication, les cellules de travail intégrées combinent des modules de centrifugation, de filtration et de chromatographie sous un seul système de contrôle. Ces systèmes réduisent les erreurs manuelles, permettent l'enregistrement en temps réel des données et facilitent le fonctionnement sans surveillance pendant de longs cycles de purification.

Technologie d'analyse des processus (TAP) et surveillance en temps réel

L'adoption de la technologie d'analyse des procédés (PAT) transforme le DSP d'une approche en boîte noire en une opération transparente et riche en données. Les sondes de spectroscopie infrarouge proche (NIR) et Raman insérées en ligne peuvent mesurer la concentration en protéines, les niveaux d'agrégats et les profils d'impuretés en temps réel.

Traitement continu

Les systèmes de chromatographie continue comme la chromatographie périodique en contre-courant (PCC) et les systèmes de lit mobile simulé (SMB) augmentent l'utilisation de résine, réduisent la consommation de tampon et permettent le fonctionnement à l'état d'équilibre. En mode continu, l'étape de capture (généralement protéinique A affinité ou échange d'ions) est exécutée en séquence avec deux colonnes ou plus, permettant de charger une colonne tandis qu'une autre est éluée et régénérée. Le résultat est une augmentation de 2 à 3 fois de la productivité par unité de résine.

Utilisation de techniques d'affinité et de chromatographie

La chromatographie demeure le cheval de bataille de la purification biologique.Pour les produits végétaux, la sélection des adsorbants doit tenir compte de la présence de contaminants spécifiques à la plante, tels que la chlorophylle, les polysaccharides et les alcaloïdes.

Ligands d'affinité spécifiques aux végétaux

Les ligands d'affinité traditionnels comme la protéine A pour la capture d'anticorps sont coûteux et peuvent se lixivier dans le produit. Pour les anticorps fabriqués par des plantes, les chercheurs ont conçu des ligands personnalisés qui reconnaissent les structures glycanes propres aux systèmes d'expression végétale (p. ex. bêta-1,2-xylose et alpha-1,3-fucose). Ces ligands offrent une grande sélectivité tout en évitant la réactivité croisée avec les protéines des cellules hôtes des mammifères.

Chromatographie et colonnes monolithiques

Les colonnes de chromatographie en lit de membrane traditionnelle souffrent de chutes de pression et de débits limités lors du traitement des extraits de plantes visqueuses ou de particules. Les adsorbeurs de membranes, des feuilles poreuses de cellulose régénérée ou de polyéthersulfone fonctionnellement avec des groupes d'échange d'ions ou d'affinité, offrent un mécanisme de transport de masse convectif qui permet de traiter à des débits beaucoup plus élevés avec une contre-pression plus faible. La chromatographie en membrane est particulièrement efficace pour le polissage par écoulement, où la capacité de contaminants n'est pas nécessaire.

Chromatographie mixte et multimodale

Les résines à mode mixte combinent deux types ou plus d'interaction (p. ex. échange d'ions et interaction hydrophobe) sur le même ligand. Cette sélectivité orthogonale peut résoudre des espèces difficiles à séparer en utilisant la chromatographie monomode. Pour les extraits végétaux, les résines à mode mixte comme Capto MMC ou Nuvia cPrime montrent une excellente capacité à éliminer les acides nucléiques, les endotoxines et les pigments colorés tout en maintenant une récupération élevée de la protéine cible.

Intégration des étapes en aval

Le DSP traditionnel comporte une séquence linéaire d'opérations unitaires distinctes : clarification, capture, purification intermédiaire, polissage et formulation. Chaque étape introduit la perte de produit, la dilution et les délais. L'intensification du processus par l'intégration des étapes est une tendance émergente clé qui réduit ces inefficacités.

Capture continue avec alimentation directe

Des systèmes tels que le BioSC® de Novasep ou le ÄKTATM pcc de Cytiva permettent d'alimenter directement la colonne de capture avec un extrait végétal préfiltré mais non entièrement clarifié. En utilisant une colonne de protection ou un filtre de profondeur devant la colonne de capture, ces systèmes peuvent tolérer certaines particules, éliminant une étape de centrifugation ou de microfiltration séparée. Le couplage direct de l'extraction et de la capture réduit le temps de traitement total et minimise l'exposition aux protéases végétales.

Filtration et conditionnement en ligne

Au lieu de recueillir des éluats dans les réservoirs et d'ajuster le pH et la conductivité avant la prochaine étape de chromatographie, les systèmes modernes de DSP intègrent la dilution en ligne et l'ajustement du pH à l'aide de mélangeurs dynamiques. La diafiltration en ligne à l'aide de modules de filtration en flux tangentiel peut concentrer et échanger le produit en continu, se nourrir directement dans une colonne de polissage en aval.

Solutions jetables intégrées

Les technologies à usage unique sont devenues des normes dans la fabrication en phase initiale et sont maintenant en train de migrer vers la production commerciale de produits biologiques à base de plantes. Les filtres jetables à profondeur, les capsules de chromatographie membranaire et les sacs bioréacteurs pour le stockage intermédiaire permettent un passage rapide entre les produits et réduisent les charges de validation du nettoyage. L'intégration de modules jetables dans une plateforme à skis (par exemple, le concept KUBioTM) permet aux fabricants de mettre en place un train complet en aval dans une configuration prévalidée, plug-and-play.

Focus sur la durabilité et le traitement écologique

Les produits biologiques à base de plantes offrent déjà un meilleur environnement en amont en éliminant le besoin de composants dérivés des animaux et en réduisant la consommation d'énergie par rapport à la fermentation bactérienne ou mammifère. Cependant, le traitement en aval utilise traditionnellement de grands volumes d'eau, de solvants organiques et d'équipements à haute énergie.

Réduction de la consommation d'eau et de tampons

Les systèmes de chromatographie continue réduisent la consommation de tampon de 50 à 70 % par rapport au mode de fabrication par lots, car les colonnes sont chargées à près de la percée et éluées avec des volumes plus faibles. La concentration en ligne et la diafiltration réduisent également le nombre de cycles de dilution et de recentration. De plus, l'utilisation de résines à haute capacité et d'adsorbeurs membranaires réduit les volumes de lit requis, réduisant directement la demande d'eau.

Solvants verts et modules jetables

Les travaux sont en cours pour remplacer les solvants traditionnels (p. ex., l'acétonitrile pour le polissage des CLHP) par des solutions de remplacement plus vertes comme l'éthanol, l'isopropanol ou le dioxyde de carbone supercritique. Pour les extraits végétaux, on étudie les étapes de précipitation ou de cristallisation à base d'éthanol comme solutions de rechange non chromatographiques pour la capture initiale des protéines, réduisant ainsi le besoin de résines coûteuses.

Valorisation des déchets

Une autre tendance à la durabilité est la valorisation de la biomasse végétale après extraction.Au lieu de jeter du matériel végétal usé, les entreprises étudient la récupération des métabolites secondaires, des fibres alimentaires ou des biocarburants de la biomasse résiduelle.Par exemple, N. benthaiana les feuilles après extraction de protéines recombinantes peuvent être traitées pour extraire des polyphénols avec des propriétés antioxydantes, créant ainsi un flux de revenus supplémentaire.

Défis et perspectives d'avenir

Malgré des progrès importants, plusieurs obstacles subsistent avant que les produits biologiques végétaux ne atteignent la parité avec les plates-formes de mammifères établies à l'échelle industrielle. Les défis les plus pressants sont l'évolutivité des nouvelles techniques d'extraction et de chromatographie, le coût des ligands d'affinité personnalisés et la normalisation réglementaire des impuretés spécifiques aux végétaux.

Scalabilité des nouvelles technologies

Bien que l'ATPE, la chromatographie membranaire et le traitement continu fonctionnent bien aux échelles banc et pilote, l'échelle jusqu'à des milliers de kilogrammes de biomasse par lot n'est pas toujours simple. Le temps de mélange, les coefficients de transfert de masse et les contraintes de chute de pression changent avec l'échelle, et l'absence d'équipement commercial pour certaines technologies nouvelles (p. ex., les piles à membrane grand format pour les vecteurs viraux directs) ralentit l'adoption.

Coût des services de médias et de ligature personnalisés

Pour les produits en phase initiale, le coût d'une résine personnalisée peut être prohibitif. Cependant, comme le nombre de produits biologiques végétaux entrant dans les essais de phase III augmente, les économies d'échelle entraîneront des coûts de ligand. Entre-temps, les fabricants explorent des résines d'affinité réutilisables et des échafaudages alternatifs à faible coût tels que les protéines de répétition ankyrine conçues (DARPins) comme agents de capture.

Considérations réglementaires

Les organismes de réglementation comme la FDA et l'EMA ont de plus en plus accepté les systèmes à base de plantes, comme en témoignent l'approbation d'Elelyso® (taliglucérase alfa) par les cellules de carottes et l'autorisation d'utilisation d'urgence des vaccins COVID-19 fabriqués sur des plantes (sanofi/GSK et Medicago). Toutefois, les préoccupations concernant les profils de glycosylation (surtout la présence de glycols spécifiques à la plante) et le potentiel d'agents adventices exigent des études de clairance robustes pendant le PSD.

Orientations futures

En ce qui concerne l'avenir, la convergence de l'apprentissage automatique avec le développement de processus à haut débit promet d'accélérer l'optimisation du DSP pour chaque produit biologique végétal. Les algorithmes AI formés sur de grands ensembles de données d'écrans de résine, de courbes de rupture et de profils d'impuretés peuvent recommander des séquences chromatographiques optimales et des conditions d'exploitation dans le silico, réduisant ainsi la charge expérimentale.

En résumé, le traitement en aval des produits biologiques végétaux évolue rapidement grâce à des innovations dans les domaines de l'extraction, de l'automatisation, de la chromatographie, de l'intégration des procédés et de la durabilité.

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