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Introduction : Le besoin de précision en biologie cellulaire
La biologie moderne exige de plus en plus la capacité d'étudier les cellules non pas comme des populations moyennes mais comme des acteurs individuels dans des systèmes complexes. Que l'étude des facteurs génétiques d'une tumeur, le décodage des circuits neuraux du cerveau ou la compréhension de la différenciation des cellules souches, les chercheurs exigent des méthodes pour isoler des types de cellules spécifiques avec précision chirurgicale. Capture laser La microdissection (LCM) est apparue comme une technique puissante et basée sur le laser qui permet l'extraction sélective de cellules ciblées directement à partir de sections de tissus hétérogènes ou de cultures cellulaires.
Cet article présente un aperçu technique complet de la MCV, de ses principes fondamentaux et de son déroulement progressif à ses applications diverses, à ses défis communs et à ses innovations émergentes.
Qu'est-ce que la microdissection de capture laser?
La microdissection de capture laser (LCM) est une technique sans contact, à guidage au microscope, qui utilise un laser pour couper et isoler des cellules ou des groupes de cellules spécifiques à partir d'un échantillon de tissu solide ou d'une monocouche de cellules cultivées. La méthode a été développée pour la première fois au milieu des années 1990 aux National Institutes of Health, principalement pour répondre au besoin de populations de cellules pures en génomique du cancer.
Le principe fondamental est remarquablement simple : une section histologique ou un plat de cellules cultivées est placé sur le stade d'un microscope spécialisé inversé. L'opérateur voit l'échantillon, identifie les cellules d'intérêt basé sur la morphologie, la coloration histochimique ou des marqueurs fluorescents, puis utilise un laser contrôlé par ordinateur pour couper autour de ces cellules. Le matériau isolé est ensuite recueilli dans un tube pour l'extraction d'acides nucléiques, de protéines ou de métabolites. Le LCM est distinct de la cytométrie en flux ou de la capture laser sans coupe-il conserve l'architecture spatiale du tissu et permet la récupération des cellules dans leur microenvironnement naturel.
Les principales caractéristiques de la ML comprennent:
- Haute résolution spatiale:[ Peut isoler des cellules uniques ou de petits groupes.
- Avaries secondaires minimales: L'énergie du laser est précisément concentrée, réduisant ainsi les dommages thermiques aux cellules adjacentes.
- Guide visuel: Morphologie et coloration spécifique guide sélection des cellules.
- Compatibilité avec les essais en aval:[ Le matériau collecté fonctionne avec PCR, microarrays, RNA-seq et spectrométrie de masse.
Le flux de travail de la ML : un guide étape par étape
La réussite de la MCV exige une attention particulière à chaque phase du processus, de la préparation des échantillons à la collecte. Voici une ventilation détaillée de la procédure standard.
1. Préparation et fixation des échantillons
La plupart des protocoles recommandent des tissus surgelés de flash intégrés dans un composé à température de coupe optimale (OTC), sectionnés à 5-10 μm d'épaisseur et montés sur des lames spéciales revêtues de membrane (p. ex., des lames de membrane PEN ou PET). Pour les cultures cellulaires, les cellules sont cultivées directement sur des lames de membrane ou sur des lames de couverture qui peuvent être transférées sur une lame. La fixation est généralement effectuée avec de l'acétone à froid, de l'éthanol ou du méthanol. La fixation de formine est évitée pour les études d'ARN parce qu'elle relie les acides nucléiques et dégrade l'ARN, mais pour l'analyse de l'ADN et des protéines, une fixation légère de formine suivie d'un traitement minutieux peut être utilisée.
2. Tente pour la visualisation
Pour identifier les cellules d'intérêt, la section est colorée. L'hématoxyline et l'éosin (H&E) sont les taches les plus courantes pour l'identification morphologique, mais l'immunohistochimie (IHC) ou l'immunofluorescence (IF) peuvent être utilisées pour cibler des marqueurs protéiques spécifiques. La coloration doit être faite rapidement et dans des conditions sans RNase si l'ARN doit être extrait.
3. Microscopie et sélection des cibles
La diapositive est placée sur la scène du microscope du système LCM. L'opérateur utilise une caméra numérique haute résolution et une interface logicielle pour analyser le spécimen. L'imagerie par champ lumineux ou fluorescence permet de sélectionner des cellules répondant à des critères prédéfinis (par exemple Ki-67-positive, GFAP-positive ou cellules à noyaux atypiques) en dessinant des régions d'intérêt sur l'écran.
4. Découpe au laser (dissection)
Deux technologies laser primaires sont utilisées : lasers de coupe UV (ultraviolet) et lasers de capture IR (infrarouge)[. lasers UV (355 nm) ablatent un chemin étroit autour des cellules sélectionnées, coupant à travers le tissu et la membrane. Le laser est scanné le long du polygone défini, et les cellules de coupe restent attachées à la diapositive par gravité. lasers IR (p. ex. 800 nm) fusionnent un film adhésif thermoplastique placé sur le dessus du tissu—cellules collent au film lorsque le laser est tiré. Certains systèmes combinent à la fois : UV pour couper et IR pour capturer.
5. Collecte de cellules isolées
Les méthodes de collecte des cellules dissoutes varient selon le système.
- Catapultation sous pression (LPC):[ Un bref pouls laser à haute énergie soulève la pièce de tissu coupée dans l'air, où elle est captée par un bouchon de tube recouvert d'adhésif ou rempli de tampon.
- Capture du capuchon adhésif :[ Après la coupe, un bouchon avec du matériau adhésif est pressé sur l'échantillon et enlevé, en prenant les cellules coupées avec lui.
- Drop gravitationnel:[ La pièce coupée tombe dans un tube placé sous l'étape.
Le matériel recueilli est immédiatement placé dans un tampon de lyse ou un milieu d'extraction pour préserver l'intégrité moléculaire.
Types de systèmes LCM
Comprendre les différences entre les plateformes de GCV aide les chercheurs à choisir la meilleure approche pour leur application spécifique.
| Feature | UV Laser Cutting | IR Laser Capture |
|---|---|---|
| Laser type | Pulsed UV (355 nm) | Continuous IR (800 nm) |
| Mechanism | Photoablation (cuts tissue) | Thermal adhesion to film |
| Resolution | Single cell possible | Typically groups of cells |
| Speed | Fast | Fast (capture step) |
| Sample type | Thin sections, membranes | Thick sections possible |
| RNA preservation | Excellent (no heat) | Good (brief heat pulse) |
Les systèmes commerciaux populaires comprennent le Carl Zeiss PALM MicroBeam (à base de LPC, coupe UV), le Leica LMD6/LMD7 (coupage UV, collecte de gravité) et l'ArcturusXT (IR et UV combinés). Tous sont compatibles avec la microscopie en champ lumineux et la microscopie à fluorescence.
Principales applications de la recherche biologique
LCM a joué un rôle important dans la progression de nombreux domaines. Ci-dessous sont des exemples représentatifs ayant une signification réelle.
Génomique du cancer et hétérogénéité des tumeurs
Les tumeurs solides sont une mosaïque de cellules malignes, de cellules stromales, de cellules immunitaires et de vascularisation. Le séquençage en vrac peut masquer les mutations critiques du conducteur qui ne se trouvent que dans un sous-clone. Le LCM permet d'isoler les cellules tumorales pures de régions spécifiques (p. ex., le front envahissant, les carottes nécrotiques ou les niches périvasculaires). Par exemple, le LCM a été utilisé pour comparer les mutations dans les tumeurs mammaires primaires par rapport aux métastases de ganglions lymphatiques appariées, révélant les modèles d'évolution de la lignée.
Neuroscience : Décoder les circuits neuraux
Le LCM permet aux chercheurs d'isoler des neurones spécifiques exprimant un marqueur particulier (p. ex., tyrosine hydroxylase dans les neurones dopaminergiques) de sections gelées, ce qui a permis de profiler l'expression génique dans les neurones de Parkinson, qui sont des substantia nigra, ou d'identifier des sous-types neuronaux uniques dans le cortex. La combinaison du LCM et du RNA-seq à cellules uniques a permis de mieux comprendre les mécanismes neurodégénératifs des maladies.
Recherche en biologie du développement et en cellules souches
Pendant l'embryogenèse, les cellules subissent des changements rapides de devenir dans des domaines spatiaux distincts. LCM a été utilisé pour isoler la crête neurale, le notochord ou le bourgeon des membres des embryons précoces pour étudier des programmes de transcription spécifiques à chaque stade.
Analyse de l'ADN médico-légal et archéologique
La ML est un outil de génétique médico-légale qui permet de recueillir un très petit nombre de cellules (p. ex., à partir d'échantillons d'ADN tactile ou de spermatozoïdes provenant de taches mixtes) pour le profilage en aval de la répétition en tandem (STR).
Surmonter les défis communs dans le domaine de la gestion des ressources biologiques
Malgré sa puissance, LCM nécessite une optimisation soigneuse. Les défis suivants sont fréquemment rencontrés et peuvent être atténués avec des protocoles appropriés.
Intégrité de l'ARN et contamination par les ARN
Pour maintenir l'intégrité de l'ARN, tous les réactifs et les lames doivent être exempts de RNase. Travaillez dans un environnement sans RNase, utilisez de l'eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) et gardez les échantillons à froid pendant la coupe (utiliser un stade froid). Une mesure courante est le numéro d'intégrité de l'ARN (RIN); les échantillons de LCM devraient idéalement avoir RIN > 7. Les protocoles de coloration rapide (moins de 5 minutes) et la collecte immédiate en un dénaturant puissant (p. ex., le thiocyanate de guanidinium) sont critiques.
Contamination des cellules environnantes
Pour réduire la contamination, il est possible d'obtenir une marge de 5 à 10 μm à partir des cellules cibles. Pour les populations très rares, une approche en deux étapes (abord couper une région plus grande, puis recouper un noyau pur) peut améliorer la pureté. Vérifiez toujours la pureté par inspection microscopique du matériau capturé ou en analysant un petit aliquot avec PCR pour les marqueurs de cellules non ciblées.
Limites de quantité de l'échantillon
Pour l'ARN, il faut utiliser des étapes de préamplification (par exemple, amplification linéaire ou méthodes basées sur PCR) mais être conscient des biais. Pour les protéines, les techniques d'amplification des signaux (par exemple, amplification des signaux de tyramide) ou la spectrométrie de masse à microéchelle sont nécessaires. La planification et la mise en commun de multiples captures peuvent aider, mais il faut être prudents quant à la mise en commun d'informations spatiales dans différentes régions si l'on tient compte de l'importance de l'information spatiale.
Meilleures pratiques pour réussir la MCV
À partir de l'expérience de nombreux laboratoires, les lignes directrices suivantes augmentent les taux de réussite :
- Optimiser l'épaisseur de la section:[ 5-7 μm pour l'ARN, 7-10 μm pour l'ADN/protéine. Les sections plus épaisses coupent mal et risquent de dégradation de l'ARN.
- Utiliser des lames de membrane : Les membranes de naphtalate de polyéthylène (PEN) fournissent une coupe propre avec des débris minimes.
- Conserver les échantillons à froid: Couper à -20 °C pour supprimer l'activité de la RNase.
- Temps de coloration limité:[ H& rapide;E ou utiliser du cresyl violet (0,5% pendant 30 secondes) pour minimiser la perte moléculaire.
- Utiliser des contrôles négatifs :[ Inclure une capture du tampon seulement et une capture d'une zone sans cellules pour vérifier la contamination.
- Caligré le laser quotidiennement:[ La puissance, la concentration et la vitesse de coupe du laser doivent être ajustées pour chaque type d'échantillon.
Pour une référence détaillée au protocole, voir le protocole de la LCM sur l'échange de protocoles.
Orientations futures et innovations
Le domaine de la microdissection de capture laser évolue rapidement, grâce à l'intégration de technologies de pointe.
Intégration avec les Omics monocellulaires et spatiales
Les plates-formes de séquençage de la prochaine génération permettent maintenant l'analyse transcriptomique à partir de cellules individuelles capturées par le LCM. Le couplage du LCM avec la transcription inverse à l'échelle microfluidique ou nanolitre permet la transcriptomique monocellulaire résolue spatialement. De même, le LCM est combiné à l'imagerie par spectrométrie de masse (MSI) pour fournir des données protéomiques et métabolomiques provenant de la même section tissulaire.
Automatisation et apprentissage automatique
Le choix manuel des cellules prend du temps. Le nouveau logiciel intègre l'apprentissage automatique pour identifier automatiquement les types de cellules en fonction de la morphologie nucléaire ou de l'intensité de coloration. Ces algorithmes peuvent tracer les limites des cellules et planifier des chemins de coupe optimaux, augmentant le débit et la reproductibilité.
MLV à cellules vivantes
Traditionnellement, le LCM est réalisé sur des échantillons fixes ou congelés. Des innovations récentes permettent de capturer des cellules vivantes dans des plats de culture à l'aide d'un laser IR de faible puissance pour fixer doucement les cellules à un film, qui sont ensuite cultivées ou analysées.
MCM multimodal
La combinaison du LCM et d'autres techniques de microscopie (p. ex. spectroscopie Raman ou microscopie multiphotonique) permet de sélectionner des échantillons en fonction de caractéristiques chimiques ou structurelles sans coloration, sans préserver l'état moléculaire natif, particulièrement pour les échantillons délicats comme les tissus végétaux ou les matériaux archivés.
Ces innovations sont détaillées dans des revues récentes, comme un résumé complet des applications de la ML dans la recherche sur le cancer publié dans le PMC.
Conclusion
La microdissection de capture laser reste un outil indispensable pour isoler des cellules spécifiques à partir d'échantillons hétérogènes. Sa capacité à combiner des conseils morphologiques avec une récupération précise et sans contamination a permis de débloquer des découvertes dans la génomique du cancer, les neurosciences et au-delà. Bien que des défis comme la préservation des ARN et des rendements faibles nécessitent une optimisation minutieuse du protocole, la technique continue de mûrir, avec l'automatisation et l'intégration des omiques spatiales élargissant son utilité.