חלבונים ממונדסים ביו-מולקולות המשלבים שני תחומים חלבון פונקציונליים או יותר באמצעות גישה DNA חוזרת, הם משמשים נרחב במחקר, אבחון וטיפולים כדי לשפר את הביטוי, לפשט את הטיהור המבני, לשפר את ה-Solubility, או לאפשר הסרת חלבון היתוך ספציפי של המערכת (מתאים) באמצעות חלבון ה-Occ-inated-aconlimate (Modericumcation) של חלבון ה-acontation) של חלבון ה-moation) ה-upation-action-upation (Moderic) של חלבון ה-moectation) של חלבון ה-Modericumcation) של חלבון, כולל חלבון ה-Moderation) של חלבון ה-molementic-molementic-molementicumlevenation) של חלבון (Moderic-upto-upto-upto-upto-upto-upto-upation) (Moderation) של חלבון ה-upto-upto-upto-upto-upine) של חלבון, כולל חלבון, בשל חלבון ה-mosolation) של חלבון, אשר עשוי להיות מהפך לחלבון (Moderic Reconine-upto-a

תפקיד עיבוד Downstream בייצור חלבון Fusion

עיבוד Downstream כולל התאוששות, טיהור ונוסחאות סופיות של מוצר חלבון לאחר ביטוי.עבור חלבונים היתוך, התהליך כולל בדרך כלל קציר תאים, lysis או שחזור חשאי, לכידת ראשונית (למשל, chromatography זיקה יעילה באמצעות תג היתוך), ניקוי צעדים, הסרת יעילות והתאמה ספציפית של ההשפעה הישירה של המוצר, תשואה, עלייה ועלויות אנזימים מחייבות לאנזימים ראשוניים, היא בעיקר אנזימים יעילים של חלבון, עם גירוי יעיל של חלבון אובייקטיבי, עם גירוי יעיל של יעילות, עם גירוי יעיל של לחץ דם יעיל של חלבון יעיל של יעילות וזרימת מטרה.

הבנה של Enzymatic Cleavage

ניקוי אנזיםמטי בהקשר זה כרוך בשימוש של protease ספציפי רצף שמכיר מוטיב חומצי אמינו קצר מוגדר מונדס בין תג היתוך לבין חלבון היעד.ההההה הידרוליזה את האג"ח peptide בנקודה מסוימת בתוך אתר זה הכרה, שחרור החלבון היעד מן התג.האתר של הניקוי נועד להיות מקופל מן המטרה אל תוך חלבון פנימי כדי למנוע פעילות גופנית ודימום בדרך כלל.

מכניזם של פעולה

רוב ההסתברות של היתוך חלבון cleavage שייך לתרופה הרחם או למשפחות protease ציסטאין חשוב.הם מעסיקים טריאד קטליטי או אדי לבצע התקפה ניוקלפילית על פחמן של פחמן של רצף peptle; התגובה מתקדמת דרך ביניים tetedral, מייצב על ידי האתר הפעיל, ובסופו של דבר שחרור NFin על ידי שרשרת חלבון ספציפי cen הוא מזהה כיסנטימי על ידי Ctermus.

מפתח Enzymes עבור FU Fusion חלבונים קלבאז'

כמה הסתברות זמינה מסחרית משמשים נרחב להסרת תג חלבון היתוך.לכל אחד יש רצפי הכרה ייחודיים, תנאים אופטימליים ופרופילי עלות.בחירה של אנזימים תלויה ביציבות של חלבון היעד, תג ההיתוך המשמש, ודרישות מטה הזרם.

TEV Protease

(FLT) Protease הוא הסתברות ציסטנית אשר מזהה את רצף ה- hepblockptide (FLT:0ENLYFQ UGuaFLT5 1 (או ENLYFQ & #85;S עם יעילות נמוכה יותר של cyd) וסובלנות עבור מגוון של תנאי buffer (pH6.5-7.5, 430) ניתן לייצר את זה באופן איטי יחסית עבור ניתוח קיסרי.

Thrombin

Thrombin הוא רצף של קרינת ה- coagulation כי cleaves ברצף ההכרה (FLT:0LVPR & #85;GSFLT:1 זה משמש נרחב בגלל זמינות מסחרית ופעילות חזקה תחת תנאי butic סטנדרטי (pH 7.4-8.0, 3 ° C).

גורם Xa

(הופנה מהדף FPXa הוא עוד פיתוי של ריצוף ⁇ (הופנה מהדף רצף (FLT:0IEGR UFLT:1) (עם הניקוי המתרחש לאחר arginine) ולעתים קרובות דורש שאריות נוספות של פיזור ספציפי עבור טיפול אופטימלית (למשל, IE U X Factora הוא מאוד עובד ספציפי ב- pH) אם הוא נפוץ, 000-Crepation הוא בדרך כלל, הוא מכיל טיפול בחלבון (DV) ו-DVatepation) הוא בדרך כלל, אם הוא מכיל טיפול תרופתי (DVatepation) ו-R.

עוד אישורים בלתי אפשריים

(הופנה מהדף DR) אנזימים יעילים נוספים (Clocks DDK U FLT:2SUMO-MO-Proterokinase הפונקציה 1LT) (הכולל DDDDK U), ® (החליפה של חלבון מסוג C-termary) היא בעלת ערך חלבון ספציפי של חלבון (C-RIRDVT) ו-RIRDIRDIOLDIOC (החליפה) אשר דורשות על ידי ® (החליפה) באופן מיידי (החליפה) ו-RIRDVMADVMADIOSTFIRDILDL)

יתרונות על שיטות כימיות

סוכנים של ניקוי כימי, כגון cyanogen bromide (CNBr, ספציפי עבור שאריות methionine), או hydroxylamine (במיוחד עבור אג"ח Asn-Gly) יכול גם להסיר תגי היתוך, אבל יש להם חסרונות משמעותיים בשילוב של מצבים aligic.

אתגרים ב- Enzymatic Cleavage

למרות היתרונות שלה, cleavage אנזים הוא לא ללא אתגרים.הנושאים הבאים יש לטפל כדי להשיג עיבוד יעיל ואמינה.

In Complete Digest

cleavage לא שלם יכול להתעורר מיחס אנזים תת-אופטימי ל-substrate, זמן לא מספיק לא-השקע, או hindrance סטריקאי של אתר ההכרה בשל קפל חלבון.לדוגמה, אם אזור המקשר בין התג והמטרה הוא קצר מדי או קבור בתוך דומיין מובנה, ההסתברות לא לגשת לאתר.זה יכול להיות מצמצם את ההנדסה על ידי קישור גמיש ו- GORGREGREGK.

פעילות מופרזת ו- non-specific Cleavage

כמה הסתברות, במיוחד thrombin ו- Factor Xa, יכול להציג exoprotease - כלומר, הם עשויים להסיר שאריות N-טווח מהחלבון היעד לאחר הניקוי המיועד אם incubated ארוך מדי.זה יכול לגרום למוצר heterogeneous ללא ragged N-termini.

Enzyme Removal לאחר קלב

לאחר התגובה הנקבית, את ההסתברות עצמה חייב להיות הוסר מהמוצר.אם ההסתברות נושאת תג טיהור (למשל, ה- GST או GST), ניתן להסיר אותו על ידי סיבוב שני של chromatography affinity. לחלופין, את ההסתברות ניתן לפשט על תמיכה מוצקה (למשל, agarose berose betrasorections) אשר עשוי להיות מפשט על ידי שימוש עצמי נוסף על ידי מערכת הפעלה עצמית.

אופטימיזציה אסטרטגיות

טיהור אנזומטי יעיל דורש אופטימיזציה של פרמטרים מרובים.אסטרטגיות הבאות מועסקות בדרך כלל הן בהגדרות מחקר וייצור.

המונחים:

טמפרטורה, pH, כוח ionic, ונוכחות של תוספים (למשל, צמצום סוכנים, הרתעה) כל השפעה על פעילות ההסתברות.רוב ההסתברות יש טווח pH אופטימלי (למשל, TEV Protease pH 6.5-7.5, trombin pH 7.4-08.0) הוא בדרך כלל 4-37 מעלות צלזיוס; להאט את התגובה של חלבון (p) ו- Econtase (prep) באמצעות טיפול תרופתי) הוא בדרך כלל 1-pine-p.

הנדסה Enzyme

(הופנה מהדף האבולוציה והעיצוב הרציונלי יצרו גרסאות משופרות של הסתברות לזרז יעילות קטליטית גבוהה יותר, יציבות תרמית, ושינויים ספציפיים.לדוגמה, TEV Protease המוטאנטים עם יציבות משופרת ב-4 מעלות צלזיוס (למשל, TEVFLT:0S219VFLT:1) זמינים באופן מסחרי וריאנטנביחות עם פעילות אקסואלית מופחתת נבנות יותר ויותר בחלבון:

עיצוב ספין-פרז'ן

עיצוב נכון של מבנה ההיתוך חיוני עבור cleavage zymatic.רצף הקישור המחבר את התג וההמטרה צריך להיות ארוך מספיק (בדרך כלל 5-15 חומצות אמינו) גמישה כדי לאפשר גישה protease.כולל רצף חלל שאינו מובנה (למשל, Gly-Ser חוזר) משפר את יעילות הניקוי.

יישומים בייצור ביופארצטי

ניקוי אנזים הוא בשימוש נרחב בייצור חלבונים טיפוליים, כולל ציטוקין, גורמי צמיחה, שברים נוגדנים מונוקלוניים, וטיפולי החלפת אנזימים.לדוגמה, ייצור אינסולין recombinant כרוך היתוך לחלבון נושא (למשל, MBP או thioredoxin) כי מאוחר יותר דבק באמצעות טיפול ספציפי להניבה פעילה, כמו גם נגד דלקת לוואי פונקציונלית (חומצה) על ידי חיסון נגד דלקת ריאות) אשר לעתים קרובות על ידי דלקת ריאות (חומצה פונקציונלית) אשר חייב להיות מוגבל) על ידי דלקת ריאות (חומצה פונקציונלית) על ידי HIV (חומצה אנטי-דלקתית) אשר לעתים קרובות על ידי חיסון נגד דלקתית) אשר לעתים קרובות על ידי דלקת ריאות (חומצה אנטי-דלקתית) אשר חייב להיות מוגבל על ידי דלקתית) אשר לעתים קרובות על ידי דלקתית (חומצה אנטי-דלקתינית) כי הוא מוגבל על ידי דלקת ריאות (חומצה רגילה (חומצה חיידקים) אשר לעתים קרובות על ידי דלקתית) אשר לעתים קרובות על ידי דלקת ריאות (חומצה חיידקים) אשר לעתים קרובות על ידי דלקת ריאות (חומצה פוליציבית) על ידי חיסון נגד דלקת ריאות (חומצה פוליצינורגנית) אשר לעתים קרובות על ידי דלקת ריאות (חומצה אנטי-ידי HIV (חומצה אנטי-ידי HIV (חומצה חיידקים

בקנה מידה תעשייתי, הסתברות משמשת לעתים קרובות בצורת unmobilized כדי לאפשר עיבוד מתמשך והסרת קלה.לדוגמה, thrombin immobilized על agarose beads יכול להיות ארוז לתוך עמודה אשר דרך זה פתרון חלבון היתוך מועבר, השגת cleavage במצב זרימה. גישה זו מפחיתה את כמות של אנזימים דרושים ו recompensees downstream עם זאת, עלולים לשלוט קצב הבקרה זהיר.

שיקולים תעשייתיים

חיפוי נזימטי ממעבדה ועד לנפח הייצור מציג אתגרים נוספים.הגבלות על העברת המונים, יציבות אנזימים על פני פעולה מורחבת, ועלות של סחורות הופכת קריטית. לעיבוד אצווה, התגובה מבוצעת לעתים קרובות בטנקים עם pH מבוקר וטמפרטורה. האנזים חייב להסיר לרמות נמוכות מאוד (בדרך כלל <1 pm) עבור מוצרים טיפוליים, אשר עשוי לדרוש צעד מלוטש (למשל, שימוש בדלקתי, או ב- קרמיקה) ללא שימוש ב-repericly).

שיקולים כלכליים כוללים גם את העלות של פלזמה בוץ עצמו.עבור תהליכים בעלי ערך גבוה, באמצעות אנזימים פחות יקרים כגון thrombin (שניתן להסיק מפלסמה בוץ) או מנדסים חיידקיים עם מחזור גבוה יכול להיות מועיל.בנוסף, תהליך טכנולוגיה אנליטית (PAT) יכול לפקח על התקדמות במשרה מלאה בזמן אמת באמצעות כרומוזומטוגרפיה נוזלית מתקדמת או שיטות ספקטרום, ספקטרום, אפילפטי, אפילפטי, הפחתת אפילפטיות .

כיוונים עתידיים

התחום של טיהור נזימטי לעיבוד חלבון היתוך ממשיך להתפתח.מגמות מתפתחות כוללות את הפיתוח של תגי היתוך "עצמי" המבוססים על טטינים (אלמנטים מעוררי חלבון) או פיזור חומרים המופעלים רק לאחר שהתג הוא הסרת מיקסום מסוים.מערכות אלה מבטלות את הצורך באבולוציה חיצונית, מפשטות את זרימת העבודה וצמצום עלויות, לעתים קרובות הם סובלים מזיהומים קינטיים או מזיהומים מסוימים יכולים להיות יעילים יותר עם מיקרובינציה אישית עם מיקרוסקופיתים באופן איטי יותר עם מיקרוסקופיתיים של חומר יעיל יותר.

לבסוף, כמו חלבונים מורכבים יותר של היתוך (למשל, נוגדנים רבים, קולטנים אנטיגנים צ'ימרניים) להיכנס לפיתוח קליני, אסטרטגיות טיהור אנזומטיות חזקות יהיה חיוני כדי להבטיח מוצר הומוגני, פעיל עם מוגדר C- ו- N-termini.ההמשך הזיקוק של עיצוב אנזימים והנדסת תהליכים יחזקו את הנקה האנזימטית כאבן הפינה של עיבוד במורד הזרם.

מסקנה

ניקוי אנזיםמטי הוא טכניקה עוצמתית ומתאמת להסרת תגי היתוך במהלך עיבוד במורד הזרם של חלבונים recombinant.הפרטים הגבוהים ותנאים קלים המוצעים על ידי אנזימים כגון TEV protease, thrombin, Factor Xa, ו-SUMO Protease מאפשר ייצור של חלבונים הנדסיים טהורים, פעילים המתאימים למחקר ושימוש טיפולי בעוד אתגרים כגון עיכול לא שלם, פעילות גופנית, אנזימים, ופתרון יעיל יותר, יכול להמשיך לפתח חלבונים יעילים יותר, ולפתח אנזימים מתקדמים יותר של יעילות בתעשייה, ולפתח אנזימים מתקדמים, וטכנולוגיות יעילות יעילה יותר, יעילות יעילה יותר, טיפולית, טיפולית, טיפולית, כדי להבטיח את יעילות גבוהה יותר, טיפול תרופתית טיפולית, כדי להבטיח את יעילות יעילה יותר, טיפולית, טיפולית, טיפולית, וקידום יעיל יותר, טיפולית טיפולית, יעיל יותר, יעיל יותר, יעיל יותר, יעיל יותר, יעיל יותר, יעיל יותר, יעיל יותר, יעיל יותר, יעיל יותר, טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפולית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפול תרופתית טיפולית