אתגר החמצן בתרבות MSC

תאי גזע mesenchymal (MSCs) מציעים פוטנציאל טיפולי יוצא דופן ברפואה רגנרטיבית, immunomodulation והנדסת רקמות.היכולת שלהם לחדש עצמי ולבודד לתוך osteoblasts, chondrocytes, ו אדמפוציטים הופך אותם אבן הפינה של טיפולים מבוססי תאים (אך, הרחבה בקנה מידה גדול של MSCs תוך שמירה על תכונות פונקציונלי שלהם נשאר משמעותי בין הפרמטרים הרבים של פעילות גופנית, במיוחד, כמו גם 2Creative ירידה בינונית של תאים).

בעשור האחרון, גוף גדל של ראיות הראה כי התאמת מתח חמצן לרמות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית - באופן חד-משמעי 1–5% - יכול לשפר באופן דרמטי את יעילות ההתרחבות MSC ואת איכות הטיפולית.הבנת המנגנונים הבסיסיים והיישום המעשי של בקרת חמצן חיונית לחוקרים ולרופאים המבקשים לייצר MSC באיכות גבוהה בקנה מידה. מאמר זה מספק סקירה מקיפה של תפקידו של מתחים בתרבות MSC, מסלולים מולקולריים מעורבים לפרוטוקולים של פשטות.

חנק חמצן פיזיולוגי: האינדיאנים MSC Niche

ב vivo, MSCs שוכן נישות היקפית בתוך מח העצם, רקמת אדניאק, ואיברים אחרים.סביבות אלה מאופיין על ידי מתחים חמצן החל מ 1% עד 8%, רחוק מתחת לרמות אטמוספריות. לדוגמה, מתח חמצן מח עצם מרחם מוערך בין 1% ל 7%, בהתאם למיקום הספציפי וvascularization.

מדוע חמצן אטמוספירי מתחלף עבור MSCs

ב 21% חמצן, MSCs נחשפים לתנאי היפר-חמצן יחסית לבית הגידול הטבעי שלהם. רמות חמצן גבוהות כאלה מגבירות את הייצור של מינים חמצן תגובתיים (ROS) בתוך המיטוכונדריה. Elevated ROS יכול לפגוע במרכיבים סלולריים - חלבונים, לימפואידים ודנ"א - ולהפעיל מסלולי אותות מתח.ממשך לאורך זמן, זה מוביל להעתק, מופחתת חיים, וקיבולת מצטברת של 25% נגד סרטן החמצן הגדלה, או יותר, או יותר, או יותר, על ידי סרטן ה- 25%, או נוגדת של DNA.

Hypoxia כאות פיזיולוגי

hypoxia (1–5% חמצן) אינו מצב מתח אלא אות פיזיולוגית הגורם לתגובות הסתגלותיות.המתווך המרכזי הוא hypoxia-inducible factor (HIF) תחת נורמוקסיה, HIF-1α הוא הידרוקסיידיד על ידי prolyl hydroxylase (PHD) אנזימים ו degraded באמצעות ה-V (V) מסלול נמוך, 000 של HIFD) הוא נוגד חמצן, והוא מאפשר לדלקת חמצן מורכב, 000.

מטרות מפתח HIF רלוונטיות ל-MSCs כוללות:

  • (ב) [13] גורם צמיחה אנדוטאלי (VEGF)FLT:1: מקדם אנגיוגנזה ותומכת בהישרדות MSC בסביבות איסכמיות.
  • (ב) ויקרא:2 ויקרא י"ד): "ו[דרוש מקור] [ה]" (ב[[1924]] ו[[1924]]]] ו[[1924]]]]]]]] ו[[1924]]]]]], [[1924]]]]]]]], [[1924]]]]]]]]]]]]
  • (ב) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • (ב) ,0) ,2, ו-NanogigphLT:1: שמור על שפע וסימן תאי גזע.

לכן, מתח חמצן הוא למעשה מחדש את הסביבה האיתנה אשר שומרת על MSCs במצב רגנרטיבי ופרו-חיים.

ההשפעה של חמצן Tension על MSC Pתפוצה

מחקרים רבים דיווחו על עלייה בשיעורי התפוצה מוגברת כאשר MSCs הם תרבותיים תחת hypoxia (1–5% O2) בהשוואה לנורמה (21% O2). ההשפעה היא בדרך כלל לאחר מספר ימים של הסתגלות ויכולה להוביל לעלייה של 1.5 עד 3 פעמים במספר התא על אותה תקופה תרבות. חשוב, ההתפשטות המשופרת אינה מלווה באובדן של יכולת הבחנה או סיכון מוגבר לצמחוני.

רמות חמצן אופטיות להפצת

בעוד שחמצן 1-5% מועיל בדרך כלל, הרמה האופטימלית המדויקת עשויה להיות תלויה במקור הרקמות וגיל התורם.עבור MSCs (BM-MSCs), 2–5% חמצן נראה להיות תלוי בהתפשטות מקסימלית.עבור מינון מפוספס של MSCs (AD-MSCs), 1–3% הוא לעתים קרובות מעדיף דם-d MSCs עשוי להגיב טוב יותר לניסויים קלים עבור תאים ספציפיים.

משך ותוצאות

היתרונות של היפותקסיה בולטים ביותר במהלך המעברים המוקדמים (P0-P5) התרבות המורחבת מעבר ל- P10 תחת hypoxia עדיין עשוי להיות יתרון, אבל התאים עשויים להתאים בהדרגה ולהראות תגובה מופחתת.בנוסף, מעבר היפותקסיה לנורמה (למשל, במהלך הקציר) יכול לגרום פרץ של ROS; פרוטוקול שיקום הדרגתי (מעל 2 שעות) מסייע להפחית את הזעזוע הזה.

שימור ופוטנציאלי הבחנה

אחד החששות העיקריים עם הרחבה גדולה של MSC הוא אובדן של רב-עוצמה - מה שמכונה לעתים קרובות "סניאנס חוזר" או "הלם תרבות" Hypoxia עוזר לשמור על פנוטיפ צעיר יותר. MSCs שגדל תחת ראייה נמוכה של SSEA-4, CD73, CD90 ו CD105 (סימנים חיוביים MSC) נמוך יותר של CD45 ו- CDCs גם לשמור על יכולת גבוהה יותר של שומן, לאחר חשיפה גבוהה יותר, לאחר חשיפה גבוהה יותר, CDx.

מעניין, hypoxia משפיע על מחויבות קואג'ה.תחת כמה תנאים, hypoxia יכול לקדם chondrogenesis ו adipogenesis תוך דיכוי אוסטאוגנזיה. עם זאת, כאשר בשילוב עם גורמים מתאימים אינדוקציה, תנאי מוקדם היפוקריקניים יכול למעשה לשפר את הגוון האוסטאוגני על ידי הגדלת Runx2 ו Osterix.

מכניזם של תחזוקת גולגולת

  • (FLT:0)HIF-2α אותing:1; בעוד HIF-1α קשורה יותר עם הסתגלות מטבולית, HIF-2α מפעילה ישירות את ה- 4 באוקטובר ו-Sox2 כדי לקיים את הגזע.
  • (ב) [ה]היפוסטון שינויים ב':1: Hypoxia משנה את מבנה chromatin באמצעות הטון דה מתילז (למשל, JMJD1A, JMJD2B), שמירה על גנים תאי גזע נגישים.
  • (ב) [15] רפורמת ה-FLT: ⁇ מייצרת פחות ROS, שמגן על הגנום ושומרת על פעילות הטלומרז.

גישות מעשיות לשליטה בחמצן

כדי ליישם תרבות היפקסית במעבדה או בהכנת ייצור, קיימות מספר אפשרויות ציוד, כל אחת עם עלויות, דיוק וקנה מידה.

Hypoxic Incubators

חומרים hypoxic ייעודי (למשל, מחברות כמו בייקר, Thermo Fisher, או Panasonic) מזרקים חנקן או תערובת חנקן / CO2 כדי לפסול חמצן.הם יכולים לשמור על רמות חמצן יציבות מ 0.1% עד 20% עם דיוק גבוה (±0.1% O2). אלה אידיאליים למחקר בקנה מידה קטן אבל יכול להיות יקר ועשויים להיות יקר מאוד ניהול קלבריציה וגזי.

ג Gas-Tight Chambers ו- Modular Incubator Chambers

עבור מעבדות על תקציב, תאים מודולריים (למשל, בילס-רוזנברג) ניתן להציב בתוך תא CO2 סטנדרטי.התאים מסולפים עם גז טרום-מעורב (למשל, 5% O2, 5% CO2, 5% CO2, איזון N2) וחתומה. גישה זו פשוטה אך פחות יציבה; רמות חמצן יכולות לנסח כאשר תא נפתח לשינויים או דגימת מדיה מתאימה לניסויים קצרים.

Bioreactors עם בקרת חמצן

עבור הרחבה קלינית ( מיליארדים של תאים), ביולוגיים כגון Quantum® (Terumo BCT) או ביולוגי גלגל אנכי (PBS Biotech) מציעים בקרת חמצן משולבת באמצעות רציה של חלל ראשי או ספורג ישיר.מערכות אלה מודדות חמצן מתמוסס (dO2) בזמן אמת באמצעות חיישנים אופטיים והתאמה של תערובת הגז בהתאם.

פרוטוקולים ל-Hypoxic MSC Culture

הצלחה עם hypoxia דורש תשומת לב זהירה לפרטים.ההנחיות הבאות יכולות לעזור להבטיח התחדשות ותוצאות אופטימליות.

הפחתה והסתגלות

MSCs נתון ירידה פתאומית מ 21% ל-1% חמצן עשוי לעבור לחץ מתמשך.ירידה הדרגתית (למשל, ירידה צעדית יותר מ 24 עד 48 שעות) יכול לשפר את ההתאמה. לחלופין, תאים יכולים להתרחב תחת נורנוקסיה לקטע הראשון, ולאחר מכן מועבר ל hypoxia עבור מעברים הבאים.זה מונע תגובה מזעזעת שעשויה להרוג חלק מהתרבות.

מדיה ותוספים

חילוף החומרים Hypoxic מסתמך במידה רבה על גליקוליסזה.מדיה צריכה להכיל גלוקוז נאותה (1-4.5 גרם / L) ולהיות מבולגן עבור ייצור הנקה מוגברת.יש חוקרים תוספת עם נוגדי חמצון כמו ויטמין C או N-acetylcysteine כדי להפחית עוד את הלחץ חמצון, אבל אלה עשויים להפריע אותות hypoxia צריך לשמש זהירות עם ptal bovine (Frum) מכיל גם את הפחתת השפעות קליניות רגישות; או ירידה; כמו x-Sfree) כי הם השפעות שליליות של הורמונים x-frexless;

ניטור חמצן

פשוט הגדרת incubator ל 5% O2 אינה מבטיחה כי התאים חווים רמה זו. חיישני חמצן ממוקמים בתוך כלי התרבות או בגז לא למדוד במדויק מה התאים רואים. טרום-הקרבה של תערובת הגז ומסייעת למנוע תנודות כאשר דלת ה- incubator נפתחת.עבור תרבויות ארוכות טווח, שקול באמצעות גלר נתונים כדי לעקוב אחר רמות חמצן.

אתגרים ומלכודות

למרות היתרונות שלה, התרבות ההיפקסטית אינה ללא אתגרים. ⁇ חמצן בתוך כלי התרבות יכול להתפתח, במיוחד בתרבות סטטית.בהשפעה גבוהה של תאים, שיעור צריכת החמצן עשוי לעלות על שיעור הפיזור, יצירת מיקרו-סביבה של היפותקסיה חמורה (near 0%) בתחתית התוספת או ה- flask. זה יכול להוביל למוות או לא רצוי שונה.

בעיה נוספת היא התגובה המשתנה של MSCs מתורמים שונים.גיל התורם, מצב בריאות, ומקור רקמות המשפיעים על רמת החמצן האופטימלית.אופטימיזציה אישית עשויה להיות הכרחית לטיפולים Allogeneic.

לבסוף, סוכנויות רגולטוריות דורשות לעתים קרובות תנאי תרבות מוגדרים היטב עבור מוצרי טיפול תאים. Hypoxia חייב להיות תועדו כפרמטר תהליך קריטי, עם חיישנים חמצן מותאמים ואזהרות. השימוש של רכיבים בעלי חיים, לצד hypoxia עשוי לסבך את האישור.

מחקרים ומחקרים Highlights

כמה קבוצות תרגם בהצלחה את ההתרחבות של MSC לייצור קליני.לדוגמה, מחקר של 2020 על ידי FLT:0Czapla et al.FLT:1 הראה כי MSCs התרחבו תחת 2% חמצן ב- bioreactor אנכי גלגל נשמר תפקוד אימונוטיפי גבוה יותר ויצרו 50% יותר vesicles מאשר תאים גדלו ב 21% חמצן, בדומה ל-FR2BRAL.

מקרה בולט נוסף: תהליך ייצור GMP-מתואם עבור MSCs העצם-derived MSCs השתמש 5% חמצן עבור שלושת הקטעים הראשונים ולאחר מכן עבר נורמולוגיה עבור שלב ההתרחבות הסופי. גישה היברידית זו מאוזנת את היתרונות של היפותקסיה עם קלות של תרבות טרמינל נורמוקסית, מניב תאים עם עוצמה גבוהה עבור שלב I ניסויים קליניים ב-Rreft-us-host.

כיוונים עתידיים: בקרה חכמה על חמצן ו-Time Feedback

הדור הבא של פלטפורמות ההתרחבות MSC יהיה כנראה לשלב ניטור חמצן בזמן אמת ושליטה הסתגלותית.חיישנים אופטיים משובצים במערכות תרבות יכול להעביר נתונים DO2 ללחיצת משוב שמתאימה לזרימת גז. אלגוריתמים למידת מכונה עשויים לחזות פרופילים אופטימליים המבוססים על צפיפות תאים, פעילות מטבולית, ותוצאה pheypic הרצויה.

יתר על כן, שילוב hypoxia עם רמזים microenvironmental אחרים - כגון מתח היתוך, נוקשות substrate, ו 3D affolds - יכול ליצור "אניצ'ה-on-a-chip" הממקסימה את ההתרחבות MSC תוך שמירה על נוקשות. מחקרים כבר לחקור כיצד hypoxia (מחזור של חמצן נמוך ונורמלי) משפיע על ביטוי MSC בהשוואה ל hypoxia מתמשך.

לבסוף, התפקיד של מתח חמצן ב Cryopreservation ושיקום לאחר-התאווה הוא אזור מתפתח.תרבות ההיפוקסטית המשוחררת עשויה לשפר את יכולת התא ואת תפקודו לאחר ההטלה, אשר קריטי לטיפולים מחוץ ל- Shelf.

מסקנה: להפוך את החמצן לנטל סטנדרטי

אופטימיזציה של מתח חמצן היא לא מותרות, אבל צורך עבור כל אחד רציני על הרחבת תאי גזע mesenchymal. על ידי התאמת תנאי תרבות עם המיקרו-סביבון הטבעי, החוקרים יכולים להשיג תשואה גבוהה יותר, טוב יותר, ושיפור תוצאות הטיפוליות. בעוד ההשקעה הראשונית בציוד היפותקסי ואימות עשוי להיות משמעותי, ההחזר - במונחים של איכות תאים והתחדשות - שווה את זה כמו שדה גדול של פעילות גופנית, להפוך את רמת החמצן של כל רמה גבוהה של רמת החמצן של רמת שליטה.

אנו ממליצים בחום שכל מעבדה כיום משתמשת ב- 21% חמצן לתרבות MSC, להתחיל עם ניסוי טייס פשוט: להשוות בין התפשטות ובדל ב 5% ו 21% חמצן על שני קטעים.התוצאות עלולות להוביל לשינוי קבוע בפרוטוקול שלך.לקריאה נוספת, להתייעץ עם משאבים כגון FLT:0 החברה הבינלאומית למחקר תאי גזע 1LT1 או FLT2: 00 השפעות על תאים אמפיריים על ידי Efarj.