טיפוח סוגים נדירים וקשה-לציית תאים מייצג אחד האתגרים המשמעותיים ביותר בביולוגיה תאים מודרניים ורפואה רגנרטיבית. תאים אלה - בין אם תאי עצב ראשוניים, תאי הבטורה, תאי גזע hematopoietic, או תאים עצביים-דרים המטופל יכולים לשמור על תאים ייחודיים, לעתים קרובות יש דרישות צמיחה ייחודיות, רגישות מעולה להפרעות סביבתיות, וקיבולת מוגבלת לחיים, אך היא יעילה לפיתוח אסטרטגיות מורכבות אלה, אך ורק כדי לפתח תאים חיוניים, לפתח תאים חיוניים, לפתח את התהליכים האידיאליים חיוניים, לפתח תאים חיוניים, לפתח תאים חיוניים, לפתח תאים חיוניים, ריפויים חיוניים, ריפוי תאים חיוניים, ריפוי תאים חיוניים, ובודדים חיוניים, ריפוי תאים חיוניים, ובודדים, אך ורקדתיים חיוניים, אך ורקדתיים, ובודדים, שמירה על ידי תאים חיוניים, אך ורקדתיים, ולפתח את שיטות התפתחותיים, אך ורקדתיים, אך ורק כדי לפתח.

הבנת האתגרים: מדוע תאים נדירים מסרבים לגדול

לפני צלילה לפתרונות, זה קריטי להעריך את המכשולים הרב-פניים שהופכים את התרבות התא הנדירה כל כך תובענית.סוגי תאים נדירים מוגדרים לא רק על ידי שפע נמוך שלהם ברקמות המקור, אלא לעתים קרובות על ידי פגיעה מוגברת לתנאי ex vivo.

  • (FLT:0) מחסור ונמוך: ההרחבה 1 (ב) תאים נדירים רבים מהווים פחות מ-1% מהרקמות המתחילות (למשל, תאי בטא פנוקריטיים, תאי גזע עצביים זעירים).
  • (FLT:0) ,Limited ProLiferative Capacity:cioFLT:1 טרמינלly מבדיל תאים כגון קרדיומציטים, hepatocytes, או קריטרוציטים ראשוניים יש פוטנציאל העתק מינימלי.הם יכולים להיכנס לsenescence או לעבור אפופטוזיס לאחר רק כמה חטיבות בתרבות.
  • (FLT:0) אי-יציבות של Phenotypic: תאים 1 LT (החלים 1) הוסרו מן הנישה הטבעית שלהם לעתים קרובות לאבד סמנים ספציפיים קואג, תבניות ביטוי גנים, ותכונות פונקציונליות.זה "השמדה" הוא בעייתי במיוחד עבור תאים גזע ותאים אפיתליים ראשוניים.
  • (FLT:0) רגישות סביבתית: LT:1 תאים נדירים הם תגובתיים מאוד לשינויים במתח חמצן, pH, osmolarity, קומפוזיציה תזונתית וכוחות מכניים.אפילו סטייה קטנה יכול לעורר תגובות מתח ומוות תאים.
  • (FLT:0) סיכוני זיהום:FLT:1) פעמים תרבות מורחבת והשימוש במדיה עשירה מגביר את הסבירות של זיהום מיקרוביאלי, במיוחד מ Mycoplasma. כי תאים נדירים לא ניתן להחליף בקלות, זיהום יכול להרוס דגימות בלתי פתירות.
  • (FLT:0) אסטרינטים אתיים ואתיים: ⁇ FLT ( 1:1 מדיה מיוחדת, גורמי צמיחה, ו substrates יקרים, בנוסף, קבלת רקמות אנושיות (למשל, מביופסיה או תרומות לאחר המוות) מעלה שיקולים אתיים ורגולציה המגדירים את הזמינות.

מעבר למחסומים אלה דורש גישה שיטתית ורב-מכוונת שמשכפלת את המיקרו-סביבון ה vivo כאמין ככל האפשר תוך צמצום הלחץ ומיקסום ההישרדות.אסטרטגיות המתוארות להלן פותחו ואומתו על פני מאות מעבדות ברחבי העולם, החל מפרוטוקולים מפורסמים ושיטות מסחריות הטובות ביותר.

אסטרטגיות לטיפוח מוצלח של תאים נדירים

אופטימיזציה של תרבות מדיה: מותאם תזונתית וזיהוי תמיכה

אמצעי תרבות סטנדרטיים כגון DMEM או RPMI-1640 מיועדים לקווי תאים חזקים, צומחים במהירות ולעתים קרובות חסרים את התוספים המיוחדים הנדרשים על ידי סוגים תאים נדירים.הגישה היעילה ביותר היא להתחיל עם מדיום בקלאלי שמתאים לדרישות הפיזיולוגיות של התאים (למשל, גלוקוז נמוך עבור כמה נוירונים ראשוניים, חומצות אמינו גבוהות עבור hepatocytes) ולאחר מכן להעשיר אותו עם תוספת מוגדרת של מצבים:

  • (FLT:0)Growth Factors ו Cytokines:03FLT) 1 חלבונים Recombinant כגון EGF, FGF בסיסי, NGF, GDNF, BMP-4, או Wnt3a חייב להיות נוסף בריכוזים מדויקים. לדוגמה, טיפוח תאי גזע עצביים אנושיים בדרך כלל דורש 20ng / mF ו ng / s / sf.
  • (FLT:0)Serum-Free or מופחת Serum Formulations:FLT:1 Serum מכיל גורמים בלתי מוגדרים שיכולים לשנות התנהגות תאים.פרוטוקולים תאים נדירים רבים משתמשים כעת בהגדרה כימית, מדיה ללא סרום עם אינסולין, העברה, סלניום, סלניום, אלביין, ונושאי ליפיד (למשל, B-27 עבור תאים עצביים, N2nalation).
  • (FLT:0)Extracell Matrix Components:03F1) משטחי תרבות מדביקים עם laminin, fibronectin, קולגן IV, או Matrigel מספק עוגן וסימנים אשר מקדמים הישרדות. לדוגמה, תאי סוללת הלבלבנטיות דורשים ממטריקס נוסף שמקורם חלבונים ממטרתיים נוספים כדי לשמור על סודיות אינסולין.
  • (FLT:0) קטן מולקולאיביטרים ומבצעים:FLT ( 1 Compounds כגון Y-27632 (מעכבROCK), CHIR99021 (GSK3 מעכב), או SB434242 ( מעכב קולטן TGF-β) יכול לשפר את הישרדות, להרחיב את תאי הגזע, או לחסום את החסימה.
  • (FLT:0) נוגדי חמצון וגורמי הישרדות:ראהFLT:1 ; N-acetylcysteine, גלוטת'יון, או ויטמינים C ו- E עוזרים ללחצים חמצון הקשורים לתנאי תרבות.

חשוב לציין שכל סוג תא מבודד חדש דורש אופטימיזציה אמפירית של רכיבים אלה.הבדיקה של לוחיות מרובות-וול יכול להאיץ את זיהוי פורמולות מדיה אופטימליות.FLT:0ATCCIRLT:1 מציעה הנחיות לתרבות תא ראשוני ותוספי מדיה המשמשים כנקודת התחלה מועילה.

מיקרונוביורימנט מימפרי: 3D תרבות, Co-Cultures, ו- Biomimetic Scaffolds

פני פלסטיק דו-ממדיים משקפים את הארכיטקטורה המורכבת ואת אינטראקציות תאי התא שנמצאו ברקמות חיים.עבור תאים נדירים וקשה-לכאורה, סביבת תרבות תלת-ממדית היא לעתים קרובות חיונית.

  • (FLT:0)3D hydrogels ו Scaffolds:03FLT ( 1:1 הידרוגל טבעי כמו Matrigel, קולגן I, או alginate ליצור מאטריקס מכווצת התומך בצמיחה תאים ו differentiation. Synthetic scaffolds (למשל, פוליcaprolactone, פוליאתילן hydrogels) מציעים תכונות סגסוגת מכנית של שבועיים של צינורות.
  • (FLT:0Spheroid and Organoid Cultures: Embeddanced:0) ,Edowded Cultures: ⁇ , straheroids או משככי איברים מחדש של רקמות (Intestinal Organoids from Single Lgr5+תאים דורשים תמצית קרום המרתף וקבוצה מוגדרת של גורמי צמיחה (Wnt3a, R-spondin, Noggin אלה 3Dit נשמרים סוגים של תאים פרוגניים וניתן להבחין תאים עבור תאים).
  • (FLT:0)-Cultures עם Feeder או תומך תאים:Felo1 תאים נדירים רבים דורשים אותות פרקרין מסוגי תאים שכנים.לדוגמה, תאי גזע hematopoietic נשמרים בצורה הטובה ביותר על שכבות מזון סטרילי המייצרות גורם תאי גזע (SCF) וגורמים אחרים. Transwell addwell addwell מאפשר לא-קשר משותף לאוכלוסיות נפרדות תוך שיתוף כל כך הרבה גורמים.
  • (FLT:0)Biomimetic Substrates: ההרחבה 1 (מתאים) עם חלבונים ECM Recombinant (למשל, viectin, laminin-511) או באמצעות תת-קרקעית peptide סינתטית (למשל, מוטיבים RGD) יכול להחליף מטבולית בעלי חיים עבור תנאים מוגדרים.

כאשר מעצבים מערכת תלת מימדית, לשקול את הנוקשות של הממטריקס (מחוש כמו Modulus של יאנג) תאי גזע נילי מעדיפים מזחלות רכות (0.1-1 kPa), בעוד אוסטאובסטוסטים דורשים סביבות נוקשות יותר (~ 30-40 kPa) ;0 CorningFLT:1 מספק Matrigel ו- scaffolds מותאם אישית עבור סוגים נדירים.

המונחים: Mimicking the Hypoxic Niche

רמות החמצן הפיזיולוגיות ברוב הרקמות נעות מ-1% ל-5% (פיסיוקסיה), הרבה יותר נמוך מ-21% חמצן אטמוספירי המשמש ב-cubators סטנדרטי.עבור תאי גזע, תאים פרוגניטיביים, תאים ראשוניים רבים, חמצן ממריץ מתח חמצן מחמצן מחמצן חמצון, נזקי DNA ושיקולים מוקדמים.

  • (FLT:0) Hypoxia Incubators או צ'מברסל:FLT ( 1:1) השתמש hypoxia עבודות היפותקסיה ייעודיות או תאים חתומות אשר שומרים 1–5% O2, 5% CO2, ולאזן N2. עבור תאי גזע עצביים עצביים, 3% O2 כפול היווצרות המושבה ושומר על רבפוטנטיות.
  • (FLT:0) Hypoxia-Inducible Factor (HIF) Pathway Stabilization: FLT:1 סוכנים Pharmacological כמו desferrioxamine או cobalt chloride יכול לחקות אותות hypoxic, אבל הם פחות יעילים מאשר חמצן נמוך אמיתי עשוי לגרום השפעות target.
  • (FLT:0)Oxygen Gradients ב 3D:03:FLT) 1 באיברים עבים יותר או spheroids, חמצן diffuses רק כ-150 מיקרומטר, יצירת ליבת hypoxic. זה יכול להיות מועיל או מזיק בהתאם לסוג התא.

החוקרים המשתמשים בשיטות נמוכות של אוקסגן צריכים לפקח על רמות החמצן לעתים קרובות עם בדיקות ולהימנע מפתיחה חוזרת של התא.

מתח מיני: דיסוציאציה ו Subculturing

דיסוציאציה סטנדרטית / DTA יכולה להרוג במהירות תאים שבריריים.במקום, לאמץ את התרגילים האלה:

  • (FLT:0) דיסאזום-חופשי דילוגציה: FIRLT:1) השתמש ב- EDTA לבד (0.02-0.05 מ"מ) או אנזימים דמויי-מינגמין (TrypLE, Accutase) עבור עיכול מתון יותר. עבור תאים דבקים יותר, incubate ב 37°C למשך רק 2-5 דקות, ניטור תחת מיקרוסקופ.
  • (FLT:0) דיסוציאציה מכנית: 1FLT:1 עבור תאים עצביים או איברים, צינורות עדינים עם צינורות מטור מלוטש או טיפ רחב מצמצם את כוחות Shear.
  • (FLT:0) ,Reduced Passaging Frequency:03FLT:1) כאשר ניתן, להימנע משינויים בשימוש במדיה בלבד, או לבצע שינויים בינוניים חלקיים.
  • (FLT:0Cryopreservation in Defined Freezing Medium:Fillo 1: תאים נדירים 1FLT צריך להיות קפוא לאט (1 ° C /min) במקפיא מבוקר או מיכל קפוא עם 10% DMSO ו בינוני מקפיא ללא סרום. Recovery ניתן לשפר את יכולת ההשתלה באמצעות תוספת של בינוני עם ROCKor Y-276.
  • (FLT:0) סוכני אנטי-פומביינג: 1 כאשר משתמשים ביולוגיים מונעים בועות עבור תרבות השעיה, להוסיף פלואורטוני F-68 כדי להפחית את הלחץ של הרדאר.

פרוטוקולים מפורטים לטיפול עדין בסוגי תאים נדירים זמינים באמצעות ההרחבה:0 (protocols.ioph1) ובכתבי עת מיוחדים כמו FLT:2 פרוטוקולי טבע מובנים: (למשל, "Isolation and Culture ofעכבר pancreatic islets" מאת סלוט אל, 2007).

תמיכה גנטית ואפילגנטית: הנדסה יציבות והתרחבות

עבור תאים שאינם יכולים להתרחב באמצעות תנאי תרבות בלבד, התערבות גנטית או אפיגנטית יכולה לקדם את התפוצה או למנוע הבחנה:

  • (FLT:0) ג'ין אקספרסion: FIRLT:1 ; ביטוי של טלמראז (hTERT) יכול לאלמוות כמה תאים ראשוניים תוך שמירה על פונקציונליות.לדוגמה, תאי גזע מנזכימיים אנושיים ממין זכר לשמור על רב-עוצמה עבור > 100 מכפילים.
  • (FLT:0)CRISPR / CAs9 Gene Editing:BuildFLT) 1 Knock-in של קולטן גורם צמיחה או עיתונאי פלורסנט יכול להקל על מעקב תאים ובחירת.
  • (FLT:0) ממריצים מולקולריים קטנים: אנדרל 1 (D DNA methyltransferase מעכבים (למשל, 5-azacydine) או מעכבי דהסטאז (למשל, חומצה valproic) יכולים להחזיר תאים למצב פלסטיק יותר.
  • (FLT:0) חידוש עצמי: התחדשות עצמי: ⁇ 1) עבור תאי גזע בשפע (iPSCs) או תאי גזע עובריים, הוספת מולקולות קטנות כמו CHIR99021 ו PD0325 (ב 2i / LIF בינוני) שומרת על מצב לא שונה ללא תאים להאכיל.

כל שינוי גנטי צריך להיות מתועדות ולאומת על יציבות phenotypic.The FLT:0AddgeneveFLT:1 , מאגר מכיל וקטורים רבים עבור אלמוות תאים ראשוניים.

טכנולוגיות מתפתחות מרחיבות את האפשרויות

העשור האחרון ראה התקדמות טכנולוגית יוצאת דופן שמטפלת ישירות באתגרים של תרבות תאים נדירה.החידושים האלה אינם רק מגבירים את שיעורי ההצלחה אלא גם מאפשרים פרדיגמות ניסיוניות חדשות לחלוטין.

תאים סטרם (iPSCs) A Platform

שיפור תאים סומטיים לתוך iPSCs יוצר מקור בלתי מוגבל תיאורטי של כל סוג תאים הרצוי.לדוגמה, iPSCs מאויש המטופל ניתן להבדיל לתוך נוירונים נדירים, קרדיומציטים, או hepatocytes עבור מחלות מודל ובדיקת סמים. היתרונות מרכזיים כוללים את היכולת להתחיל בקלות להשיג פיברסטוסטרים או תאים דם, ואת היכולת לבעוטציות גדולות יותר של תאים סרטניים.

מודלים של אורגניזמים ו-3D Tissue Models

איברים – מבנים תלת-ממדיים מאורגנים בעצמם שמקורם בתאי גזע או פורגנים רקמות – מטביעים את האדריכלות והתפקוד של איברים כגון מעיים, מוח, כליות וריאה. תרבויות אלה הן בעלות ערך מיוחד עבור סוגים נדירים של תאים שמבוססים על אינטראקציות תאיות (למשל, איברים במוח מכילים תת-סוגים עצביים מרובים, אסטרוציטים, ו- oligodenr לפרוטוקולים לטווח ארוך) של תאים.

מכשירים מיקרו-השפעה לתרבות קדם-החסין

מערכות "אורגן על שבב" מאפשרות שליטה מדויקת על זרימת הנוזל, לחץ הרהר, משלוח תזונתי, והסרת פסולת.המכשירים האלה אידיאליים לטיפוח תאים ראשוניים נדירים כי הם משתמשים במספרים מינימליים של תאים (למשל, 1,000-10,000 תאים) ויכולים לשלב חיישנים עבור ניטור בזמן אמת.

  • Liver Synoid-on-a-chip עבור הפטריוציטים העיקריים של האדם נשמר במשך 28 ימים
  • מודלים של מחסום דם-מוח באמצעות תאים אנדואליים המוח הראשי ואת pericytes
  • Bone marrow-on-a-chip תומך ב- hematopoietic תא גזע הגדל

פלטפורמות מיקרו-השפעה מסחריות מחברות כמו FLT:0 (EemulateFLT) 1:1 ו- (FLT:2Science OnlineFilloFLT 3: 3) מציעות מערכות מתקדמות וידידותיות למשתמש.

ניתוח יחיד ומינוי

לפני הטיפוח תאים נדירים, לעתים קרובות יש צורך לבודד אותם עם טוהר גבוה.טכניקות כמו תאים מנוסדים (FACS) או תאים ממונעים (MACS) יכול להעשיר תאים יעד תערובת heterogeneous. עבור אוכלוסיות נדירות מאוד (למשל, הפצת תאים ב 1 ל-107 תאים), מיקרו-השפעה "שלילית" תאים של ריצוף יחידני (למשל RNA) הם תאים מבודדים יותר ויותר.

אוטומציה ומסך גבוה

פלטפורמות רובוטיות לשינויים בינוניים, מעבר, ודמיון מאפשרות אופטימיזציה שיטתית של תנאי תרבות ב 384 או 1536-well הלוחות.על ידי שינוי פרמטרים מרובים (למשל, ריכוזי צמיחה, קשיחות ממטריקס, רמות חמצן), החוקרים יכולים לזהות במהירות תנאים אופטימליים להתרחבות תאים נדירה ללא משפט וטעייה ידני.

שיקולים מעשיים להצלחה

מעבר לטכניקות ספציפיות, מספר עקרונות אנרכיטיביים תורמים לתרבות תאים נדירה מוצלחת:

  • (FLT:0) ביצוע והתאמה: FIRLT:1) מתעד כל פרט - מספר רפעת, מספר כלי תקשורת, מקור ממטריקס, רמת חמצן, ושינויים בטיפול.
  • (FLT:0)Quality Controlהמחשה: 1FLT 1 (מבחן קבוע עבור Mycoplasma, להעריך את יכולת התא עם ניגודים כחולים או אוטומטיים, וביטוי סימון עוקב באמצעות אימונוכימיה או ציטרינומטריה זרימה.
  • (ב) ⁇ (בשיתוף) ופרוטוקולים: ⁇ 1 (בפרוטוקולים נדירים) הם פרוטוקולים תאיים נדירים רבים המבוססים על הקהילה.Utilize repositories כמו ה-FLT:2Protocols ExchangeFLT 3: (דרך הטבע) או יצירת קשר עם המחבר של פרסום רלוונטי עבור שיטות מפורטות.
  • (FLT:0) ,התמדה: FLT:1 וודא שכל רכש רקמות אושר על ידי לוחות ביקורת מוסדיים (IRBs) ולהלן תקנות כגון הכלל המשותף או ה-GDPR לדגימות אנושיות.

מסקנה: From Rare to Routine

טיפוח סוגים נדירים וקשה-לכאורה נשאר מאמץ מורכב המשלב אמנות ומדע.האסטרטגיות המתוארות כאן - מדיה מבוזרת, מיקרונומנט מחקה, תרבות היפקסית, טיפול עדין ותמיכה גנטית - הפכו את היכולת שלנו ללמוד תאים שנחשבו בעבר לתאים ייחודיים, כגון IPSCs, איברים, מיקרו-קלידיים, ועלולים להיות יותר גמישים, כדי לפתח את הגמישות של שיטות טיפול תאים, אשר נחשבומים מסוג זה, בסופו של כל אחד, כדי לפתח מחדש של תאים חדשים, ולהפחית את ההשפעות של תאים חדשים, כלומר, כלומר, כגון iPSCs, ולהפחית את ההשפעות של תאים חדשים, ולהפחית את ההשפעות של תאים חדשים, ולהפחית את הגמישות, כדי לפתח מחדש של תאים חדשים, כדי לפתח מחדש, כדי לפתח את ההשפעות של תאים חדשים, טיפול תאים חדשים, טיפול אורגניות תאים חדשים, ולהפחית את ההשפעות של תאים חדשים, כלומר, טיפול אורגניים, כדי לפתח מחדש, כדי לפתח מחדש, טיפול פסיכולוגיים, אשר בסופו של תאים חדשים, אשר בסופו של תאים חדשים, אשר יכולים בסופו של דבר, טיפול אורגניים, כדי לפתח מחדש, כמו iPSCs, כגון מחלות מתפתחות, כדי לפתח שיטות טיפול פסיכולוגיים, אשר יכולים בסופו של דבר, כדי לפתח מחדש, כדי לפתח מחדש, כדי