עיצוב מעגל גנטי: The Blueprint for Next-Generation Biochemical הפקה

בעשור האחרון, הביולוגיה הסינטטית עברה מעבר להוכחה-של ניסויים במשמעת של ייצור אמיתי.בלב השינוי הזה נמצא FLT:0genetic Circle designFLT:1 – הבנייה המכוונת של רשתות גנים מלאכותיות שהתנהגות תאית ישירה עם דיוק צפוי של מעגלים אלה יש השפעה ישירה, מדידה על מערכות ייצור כימיות של תאים, אפילו על ידי שינוי גנטיים, על ידי שינוי של תרופות הרגעה, על ידי שינוי התחממות כדור הארץ, על ידי שינוי, כמו גם על ידי שינוי גנטי יציב, כמו גם על ידי שינוי, כמו גם על ידי שינוי של תאים יציב, כמו גם על ידי שינוי של פעילות גופנית, כמו גם על ידי שינוי של תרופות.

מה הם מעגלים גנטיים?

מעגלים גנטיים הם אוספים של רצפי DNA - באופן רטי כולל מקדמים, אזורי קידוד, אתרי מחייב ribosome ומונחים - כי יחד, להתנהג כמו מערכת לוגיקה מונדסת.בדיוק כמו מעגלים אלקטרוניים משלבים טרנזירים, מתנגדים וחוטים לביצוע חישובים, מעגלים גנטיים משתמשים חלבונים רגולטוריים, מקדםים בלתי ניתנים לטיפוח, ואינטראקציות RNA כדי לגוון אותות קלט (למשל, גירוי כימי) או לייצר שינוי גנטי הרצוי).

דוגמה פשוטה היא מתג "on-off": מקדם שבדרך כלל מודחק יכול להשתחרר על ידי הוספת מולקולה מעורר, המוביל לביטוי של חלבון מטרה. מעגלים מורכבים יותר משלבים FLT:0 חיובי ושלילי לולאות משוב שלילי (ראה FLT:1, הזנה-מטיבים קדימה, ושכבות מרובות של רגולציה.

המונחים: path Circuit Behavior

כל מעגל גנטי מסתמך על קומץ של חלקים סטנדרטיים.הבנת רכיבים אלה חיונית להערכת כיצד עיצוב המעגל משפיע על נתיבי ייצור:

  • (FLT:0)Promoters ו- Ribosome Binding Sites (RBS): FLT:1 כוחו של מקדם קובע כמה פעמים RNA פוליאז יוזם תמליל; כוח RBS שולט בהקדשת התרגום. Tuning אלמנטים אלה היא הדרך הפשוטה ביותר להתאים את רמות האנזים במסלול.
  • (FLT:0) מדכאים ומבצעים: FIRLT:1 , חלבונים רגולטוריים כגון TetR, LacI, או AraC להגיב למולקולות קטנות (משווקים) או לחסום או לשפר את הליל. על ידי שכבת הרגולטורים, מהנדסים ליצור, או, לא, ולא, ושערי לוגיקה NOR.
  • (FLT:0) כמרים תקופתיים: FIRLT:1 , סיום נכון מונע קריאה-באמצעות גנים במורד הזרם והוא קריטי עבור בידוד מודולי מעגלים אחד מהשני.
  • (FLT:0) דירוגים: FLT:1 רצף קצר חלבונים או mRNAs יכול לשלוט על מחצית החיים שלהם, ומאפשר שליטה דינמית של מסלולים ביניים ולמנוע צטברות רעילה.
  • (FLT:0) חיישנים בעלי אחריות הדדית: FLT ( 1:1 חיישנים ממונדסים לזהות pH, חמצן, אור, או מטאבולטים ספציפיים וממירים את המידע הזה לפלט ביטוי גנים, המאפשר משוב בזמן אמת על מצב המסלול.

כיצד עיצוב מעגלי Reshapes Biochemical הפקה Pathways

הקשר בין עיצוב מעגלים לבין ייצור ביוכימי הוא ישיר: כל אנזים במסלול הוא תחת פיקוח תמליל או תרגום, ושליטה זו היא מה שעיגול גנטי מספק. על ידי התזזזנות בזהירות כאשר וכמה מכל אנזים נעשה, מהנדסים יכולים להשיג תוצאות קשות או בלתי אפשריות עם ביטוי סטטי, חוקתי.

הובלת יתר באמצעות תקנון דינמי

אחד השימושים החזקים ביותר של מעגלים גנטיים הוא FLT:0 דינמית תקנה של רמות אנזים FIRLT:1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 של שימוש בנתיבים טבעיים רבים, . . . . . . . . . . . . . . . . . ⁇ ⁇ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

צמצום הפסולת והמוצרים

תגובות צד בלתי רצויות הן מקור עיקרי של חוסר יעילות בתסיסה תעשייתית.ניתן לפרוס מעגלים גנטיים ל-FLT:0silence CompetitFLT:1 על הביקוש. עיצוב טיפוסי משתמש בהצטברות, רגיש לנוכחות של מוצר הרצוי, כדי לסגור מסלול מתחרה כאשר המוצר הוא בשפע.

שיפור יכולת הייצור לאורך זמן

ביו-מעבדים תעשייתיים לעתים קרובות לרוץ במשך ימים או שבועות.במשך הזמן, תאים מלוטשים, מקדם ניתן להשתיק על ידי שינויים אפיגנטיים, ותנאים סביבתיים משתנים.עיגולים גנטיים ניתן להנדס כדי להיות **לאוב להפרעות כאלה **.לאה הנקה שלילית השומרת על ריכוז פנימי קבוע של הרגולטור, למשל, ניתן לטבול שינויים נגד plasst כדי לזהות כמה מהפרעות תזונתיות או למנוע מתגים "מתאים" אם יש צורך לשלב את המשתנים הרצויים" אם יש צורך של פעילות גופנית.

« התנצלות קלאסית בשימוש בייצור

מספר עיצובי מעגלים קנטון הוכיחו שימושיים במיוחד בייצור ביוכימי.כל טופולוגיה מספקת יכולת בקרה ייחודית:

ה-Toggle Switch

במקור פותח על ידי גרדנר, Cantor, ו Collins בשנת 2000, מתג העגש מורכב משני מקדמים דוכאים מסודרים מסודרים בלולאה מדכאת הדדית.העיגול יכול להתקיים באחת משתי מדינות יציבות (הביטוי הגבוה של גן A, נמוך של גן B, או להיפך) בהקשר ייצור, מתג מגע יכול לעבור תא בין מדינה "חלשה" (שם משאבים לביוטכנולוגיה) ו"מהפכה"ממנה" (ממנה הם לעתים קרובות חומרים מטבוליים) לתוך משאבים מטבוליים).

אוספיילר (Repressilator)

בעוד oscillators מפורסם ליצירת תבניות ביטוי גנים תקופתיים, יש להם גם מקום בייצור. על ידי יצירת שחרור pulsatile של ביניים רעיל, אוצילטור יכול למנוע את ביניים מ accumating כדי לעכב רמות בעוד עדיין נהיגה גבוה פלוקס הכולל. לדוגמה, בייצור כימותרפיה paclitaxel, מדחיק יכול לשלוט בתזמון של אנזים סימטרי, הימנעות לחץ אספירין מילימטרי.

Band-Passs filter

מעגל פסים של להקה מפעיל ביטוי רק כאשר ריכוז קלט נופל בתוך חלון מסוים.זה חשוב במיוחד עבור מסלולי ייצור שבו ריכוז ביניים חייב להיות נשמר בטווח אופטימלי צר.אם ביניים הולך גבוה מדי, המעגל מקטין את הביטוי של האנזים במורד הזרם; אם הוא טיפות נמוך מדי, ביטוי עלייה.

דוגמאות אמיתיות ל-Cyber-Driven Production

ארטמיסיקאי Acid (Malaria Drug Pre ⁇ )

ייצור חומצה ארטמיאנית בהנדסת שמרים היה אחד ההצלחות הראשונות של ביולוגיה סינתטית, בעוד לא בתחילה להסתמך על מעגלים סינתטיים מורכבים, שיפורים מאוחר יותר השתמשו במערכות חיישן דינמי חיישן-regulator (ראה FLT:1 כדי לנהל את פלוקס דרך מסלול mevalonate. A מעגלים החושבים את בנייתם של sylnesylpyropus ו-Retes up the priceupretrasupretosupretosupretosupretosupretosupreto artosupretosup a אנזימים הוביל לירידה של 50% כדי להגדיל את המסלול.

דלק ביולוגי: אתנול ו- Advanced Butanol

עבור ביותנומול, פשוט גישור של אנזים ייצור אתניול עובד טוב מאוד, אבל עבור דלקים ביולוגיים מתקדמים כמו Isobutanol, רעילות היא מכשול גדול. חוקרים השתמשו מעגל החוש את הלחץ membrane שנגרם על ידי הצטברות אוובוטנול בו זמנית מפעילה משאבות יעילות תוך כדי regating אנזימים בייצור כדי למנוע את הרמה הזאת / לנגב בדרך אחרת.

כימיקלים מיוחדים: נרינגנין ו Resveratrol

צמחי פוליפנול (כמו naringenin ו resveratrol יש ערך אגוזיוטי אבל מיוצרים בתשואות נמוכות על ידי מארחים מיקרוביאליים בשל דרישות מתחרות עבור המבשר malonyl-CoA. מעגל גנטי כי up-regulates malonyl-CoA סינתזה כאשר ריכוז המוצר הוא נמוך, ומכבה אותו כאשר מצטברים, שיפרה restrosrolsal-Flierterter 3.

האתגרים של תלות קונטקסט

למרות התקדמות יוצאת דופן, עיצוב מעגלים גנטי עדיין מושפע על ידי FLT:0 context תלותיות obveFLT:1 ; מעגל המבצע באופן מושלם זן אחד או רקע גנטי אחד עלול להיכשל באחר בגלל הבדלים בגורמי תילעת אנדוגניים, זמינות פולינזיס RNA, או עומס מטבולי.

כדי לענות על זה, השדה פיתח את הרישום iGEM:0 (ספריות סטנדרטיות) חלקים TERLT:1 (למשל, אוסף אנדרסון מקדם, הרישום iGEM) וכלים חישוביים החיזוי חלק התנהגות, אך, חיזוי מוחלט נשאר חמקמק. כתוצאה מכך, מעגלי ייצור מוצלחים ביותר עדיין בנוי עם בדיקה מקיפה: בניית מודל בדיקה ⁇ .

כלים לעיצוב ובנייה של מעגלים גנטיים

עזרה ומודל

כמה כלים עיצובים (CAD) נוצרו במיוחד עבור מעגלים גנטיים.(FLT:0) Cell DesignerFLT:1,FLT:2GenoCADFLT 3, ואת ה-FLT:4SBOL (Synthetic Biology Open Language) FLT:5 מסגרת מאפשרת לחוקרים להלחין מעגלים מתחומים סטנדרטיים וסימולציה באמצעות מודלים סטנדרטיים של שיטות פעולה חיזוי-SBOL (S)

שיטות של DNA

(ב) כאשר המעגל תוכנן ב-Silico, יש צורך להרכבת פיזית שיטות כמו ההרחבה:0 Golden GatecioFLT:1 ו-FLT:2Gibson התאספותFLT:3 מאפשר את הצטרפותם של שברים דנ"א מרובים בתגובה אחת.

כיוונים עתידיים: חכם יותר ויותר מעגליות אמין

אורתולוגי אקספרסion Systems

אחד הדרכים המבטיחות הוא השימוש של RNA פוליאזsphcwinal ribosomesph 1 ו-FLT:2orthogonal RNA פולימאזsph3 (למשל, T7 RNA פולימראז) כי לא אינטראקציה עם מכונות הילידים של המארח.

CRISPR - מעגלים המבוססים על CRISPR

הפרעות CRISPR (CRISPRi) ו-CRISPR הפעלה (CRISPRA) הפכו לכלים חזקים לבניית מעגלים גנטיים. A dCas9 חלבון המפוחד יכול להיות מונחה על ידי מדריך מהנדס RNA לחסום את ה-RNA על כל מקדם - אין צורך חלבונים מדכאים מותאם אישית.

מערכות ללא תאים עבור מהירות

לא כל ייצור ביוכימי צריך תאים חיים.FLT:0 מערכות ביטוי ללא תשלום 1Felo (למשל, תמצית TX-TL) מאפשרות מעגלים גנטיים להיבדק בתוך שעות, ללא סיבוכים של צמיחה תאים, מוטציות ו רעילות.מערכות אלה משמשים יותר ויותר למעבדות ייצור ואופטימיזציה של מעגלים לפני העברת העיצוב לתאים חיים.

שילוב עם Machine Learning ו- Automation

נפח הנתונים שנוצר על ידי זרימת עבודה מלחיצה אוטומטית הוא עצום.מכונות-learning אלגוריתמים יכולים כעת להמליץ על עיצובי מעגלים, לחזות ריכוזים אופטימליים מעוררים, ואפילו להציע שילובים חדשים של מקדם-RBS שעדיין לא נבדקו. כאשר בשילוב עם ממצאות רובוטיות המחוברות בענן (למשל, מושג "BioFab" של מחקר הנדסה), העיצוב-test-S יכול להפעיל במהירות על פני מאות שלבים ביולוגיים.

מסקנה

עיצוב מעגלים גנטי התפתח מסקרנות של ביולוגיה סינתטית לכלי מעשי עבור אופטימיזציה של מסלולי ייצור ביוכימיים. על ידי מתן שליטה דינמית על רמות האנזים, דיכוי לוואי, ויציבות לטווח ארוך רב, מעגלים מעוצבים היטב יכולים להכפיל או משולשים תוך צמצום עלויות ובזבוז.הפיתוח המתמשך של חלקים סטנדרטיים, מודלים חישוביים, מערכות אוטגוניות, ו הרגולטורים המבוססים על CRISPR מיוצרת הוא נמוך יותר למתחמיכותלציה גנטית, ללא כל אחד, ללא יכולת להרחיב את הגדלה של תאים חשמליים, או להרחיב את המשתנים מבחינה מבחינה כלכלית.

(ב) [ה]הקריאה: [ה], כי אם כן, [ה], [ה] [ה]] [ה]] [ה]] [ה]] [ה]]]]] [ה]]]] [ההההה']'[ה']'[ה']'[ה']'''']'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''