מבוא ל-Reverse-Phase HPLC ו- Role of Mobile Phase

Reverse-phase High-Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) נשאר אחד טכניקות הפרידה המגוון ביותר ואומץ נרחב על פני תרופות, סביבתיות, ביוכימיות, וניתוח מזון.השיטה מסתמכת על שלב לא-קוטבי - C18, C8, או phenyl-boned silica - ושלב סלולרי-קוטב-אורגני יותר.

בעוד שכימיה שלב נייח וממדי העמודה נקבעים במהלך פיתוח השיטה, הרכב שלב נייד מציע את הגמישות הגדולה ביותר עבור כוונון של הפרדה. התאמות קטנות בסוג אורגני של פתרון, יחס אורגני למים, pH חיפר, כוח ionic, או תוספת של מודטורים יכול לשנות באופן מעמיק את זמני שימור, ספיגה ורזולוציה כללית.

תהלוכת הכותרת הטריטוריאלית של החלטה ב-RP-HPLC

החלטה (RigFLT:0) בין שני שיאים סמוכים מוגדר על ידי המשוואה הבסיסית:

(ב) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇

כאשר N הוא יעילות העמודה (מספר לוח), α הוא הגורם הסלקטיביות בין שני אריטים, ו k' הוא גורם השימור (גורם הקיבולת) של שיא שלב נייד מאוחר יותר משפיע ישירות על כל שלושת המונחים:

  • (FLT:0) יעילות (N): FLT:1 בעוד שנקבע בעיקר על ידי איכות עמודה ורמת קצב זרימה, קצב קצב קצב קצב קצב קצב הלבלב והריכוז התוספים יכול להשפיע על העברת המונים ובכך גובה הצלחת.
  • (FLT:0) סלקטיביות (α): יחס גורמי שימור לשני תרכובות הוא רגיש מאוד לקומפוזיציה שלב נייד, במיוחד סוג של סלנט אורגני ו- pH.שינוי המפתור האורגני מ אצוטוניטיל למאנול יכול להפוך את הסדר ההנעה לאחור עבור זוגות מסוימים.
  • (FLT:0) גורם קשב (k): LT:1 אחוז של שליטה אורגנית מגבילה את כוח ההנעה הכולל.תוכן אורגני גבוה יותר מפחית k' עבור כל אנאליים, דחוס את chromatogram.

הבנה מעמיקה של האופן שבו כל רכיב של שלב נייד משפיע על הפרמטרים האלה מאפשרת לאנליסט לייעל באופן שיטתי הפרדה ולא להסתמך על ניחושים.

המונחים: Mobile Phase

מים וכלבים קפואים

מים הם המפלט החלש ב-RP-HPLC. High-purity water (Type I, ⁇ 18.2 M ⁇ -CM) חובה להימנע מרעש בסיס, שיאי רוח, וזיהום עמודה. עבור זיהוי ionizable אנאליס, buffers נוסף לשלוט pH. Common buffers כוללים pus, aceate, עבור sent, ו- ptamination (אופטי) עם ריכוז נמוך (mcreic) ב-mcreca-mcretompotic) ב- 50.com) יש צורך ב-mculcal.com) עם ריכוז.comimctompe) ב-mctompe) ב-mctompe) ב-mctompampe) ב-mctomcretomcretompe) ב-mca-mca-mctompe) ב-mctompémcretomca-mca {\displaystyle 0.com (מבולגן רגיל (מבולגן (מבולגן ב-mcretomcsp; cuffiltomca) ב-m

פתרון אורגני

שלושת המנופים האורגניים הנפוצים ביותר הם אצטונייטיל (ACN), methanol (MeOH), ו-tetrahydrofuran (THF) לכל אחד יש תכונות נפרדות:

  • (FLT:0) אספקטיליה: 1FLT:1 ניגודיות נמוכה, כוח אלוטי גבוה, קיצוץ UV נמוך (190 nm) מעולה עבור הפרדה הדורשות יעילות גבוהה וניתוח מהיר.
  • (FLT:0) Methanol:FLT:1 , פתיחות גבוהה יותר מאשר ACN, אשר יכול להגדיל את לחץ הגב מספקסלקטיביות שונה, במיוחד עבור תרכובות הקוטביות לעתים קרובות בשימוש כאשר ACN אינו פותר זוגות קריטיים.
  • (FLT:0THF:EveFLT:1) אפילו חזק יותר, אבל השימוש בו מוגבל על ידי סופגנות גבוהה UV (cutoff -212 nm) ובעיות יציבות פוטנציאליות. מדי פעם מועסקים עבור סולמות הידרופוביות מאוד או כדי לשנות את הסלקטיביות באופן דרמטי.

תערובת טריאריות של מים, ACN, ומ-OH משמשים לעתים לסלקטיביות נוחה, אם כי תערובת בינארית היא נפוצה יותר עבור אינטנסיות.

תוספות ו- Ion-Pairing Reagents

עבור אריחים טעונים (למשל, חומצות carboxylic, amines, peptides), בשלב הנייד pH בשלב יש לשלוט כדי להבטיח מצבי ionization עקביים. Ion-pairing reairing reasures כגון heptafluorobutyric חומצה (HFBA) או triethylammonium פוספט ניתן להוסיף כדי להגדיל את שימור מינים ionic על ידי יצירת זוגות נייטרליים כי הם בשלב זה יכול להיות דיכוי גדול כדי להסיר אותות מסיביים יכול להיות דיכוי כי הם עלולים קשה כדי להסיר אותות.

אפקט של סוג Solvent אורגני ואחוז

הדרך הפשוטה ביותר להתאים את השימור היא לשנות את אחוז המפלט האורגני.באיזון אריסטוקרטי, יצירה קבועה משמשת לאורך כל הריצה. in ⁇ elution, אחוז אורגני עולה לאורך זמן, ומאפשר הפרדה של אריות עם מגוון רחב של הידרופוביות בריצה יחידה.

אופטימיזציה איסוציאטיבית

עבור מעצור מסוים, הפחתת אחוז אורגני מגביר את השמירה (גבוה יותר k) ובדרך כלל משפר את ההחלטה, בתנאי שזמן הניתוח נשאר מקובל מדי.כלל אצבע: ה- k' של הפסגה הראשונה צריך להיות בין 1 ל-5, והשיא האחרון בין 5 ל-20.אם ערכי k נמוכים מדי, שיאים גבוהים מדי ליד נפח הריק; אם גבוה מדי, ניתוח הופך להיות מוגזם ורחב מתרחש.

עם זאת, הגדלת שימור מגבירה גם את הסיכון של זינב שיא והלהקה הרחבה בשל העברה המונית איטית בשלב הישיבות.האחוז האורגני האופטימלי נמצא לעתים קרובות על ידי הפעלת ⁇ (למשל, 5% עד 95% B מעל 20 דקות) ולאחר מכן בחירת הרכב איזוקרטי מרכזי עניין.

« אלתור

שיטות גרפיות הן חיוניות כאשר דגימות מכילות פיאטים עם מגוון רחב של קוטביות.המדרון ⁇ (שינוי ב%B לדקה) משפיע באופן משמעותי על ההחלטה. Steeper ⁇ s דחוס שיאים אבל להפחית את ההחלטה הכוללת; רדוד ⁇ s להגדיל את ההחלטה עלות של זמני ריצה ארוכים יותר. עבור זוגות קריטיים, ⁇ מקטע (למשל, מדרון רדום דרך תחומי העניין) יכול לספק את ההחלטה ללא הגבלה מלאה.

שינויים בסלקציה בין Solvents

מעבר מ acetonitrile ל methanol (או באמצעות תערובת) יכול לשנות את הסדר של תרכובות קשורות הדוקה.זה קורה כי תכונות הפינוי של שלב הנייד להשפיע על אינטראקציות שלב אנאליט-סטציה שונה עבור כל תרכובת. כאשר שני שיאים co-elute ב ACN, צעד ראשון הוא לנסות MeOH עם כוח שווה ערך (למשל, OH) הוא חזק יותר מאשר שילוב זה.

תפקיד ה- pH ו-Buff Selection

עבור תרכובות המכילות קבוצות פונקציונליות ionizable (acids, בסיסים, zwitterions), ה- pH של החלק המפחיד של השלב הנייד הוא קריטי.

  • (ב) ויקרא י"א): "ה' (ב') ב'' (ב':א) ויקרא:2 ויקרא:2–6): "ה' (ב') ב''' (ב') ,'''' (ב') ,''''''''' (ב') ויקרא י', ו' ויקרא י' ויקרא י"ב' ויקרא י"ב', ו' ויקרא י"ב', ו' יט' ויקרא י"ב' ויקרא י"ב' ויקרא י"ב', ב')
  • (ב) [ה]הבסיסים [ה] [ה] [ה] [ה] [ה]] [ה]]] [ה]] [ה]]] [ה]]]][ה]]]] [ה]]][ה]]] [ה]][ה]]]: [ההתנהגות ה'[ה'] ה'[ה'] ה'[ה'[ה']']']'[ה']']'[ה'[ה']'[ה'[ה'[ה'[ה'[ה'[ה'[ה'[ה'[ה'[ה']']'[ה']']']'[ה']']'[ה'[ה'[ה'[ה']']']']']'[ה'[ה']']']'[ה']'[ה']']']'[ה']']'[ה'[ה'[ה'[ה']'[ה'[ה']'[ה'[ה'[ה'[ה'[ה

(ב) כדי להשיג זמני שימור מעודכנים, יש לספוג את ה- pH בשלב הנייד בתוך ±0.2 יחידות של המטרה. Buffers כגון פוספט (pKirFLT:0a2FLT:1=7.2), acetate (pKFLT:2aFLT 3=4, ו- ammon forated formate)

pH והחלטה

כאשר שני אריחים יש pKirFLT שונה:0 ערכים של PH, התאמת pH יכול לשפר באופן דרמטי את ההחלטה על ידי שינוי מצב ההון - ומכאן שמירה - של תרכובת אחת תוך השארת השני ללא שינוי יחסית. לדוגמה, חומצה קרוקסית ותרכובת נייטרלית נייטרלית עשויה לפענוח ב- pH 7; הורדת ה- pH ל-3 תישמרו את החומצה באופן חזק יותר בעוד שתרכובת הניטראלית עשויה לפתור את השינויים הקטנים.

עבור שיטות באמצעות גילוי ספקטרומטריה המונית, buffers תנודתי כמו ammonium acetate או ammonium עבור השותף נדרשים. unvolatile buffers (למשל, phopt) אינם עולים בקנה אחד עם ionation אלקטרוספיל.

משאב שימושי עבור בחירת buffer ובקרת pH הוא ה-FLT:0 [Sigma-Aldrich] מדריך שלב סלולרי HPLC הכנה FLT:1.

השפעה של כוח איטוני וסוכני Ion-Pairing

כוח איטוני מתייחס לריכוז הכולל של בצלים בשלב הנייד.הגדלת העוצמה האיטונית (על ידי הוספת מלח כמו NaCl או ריכוז חיץ גדל) יכול להשפיע על שימור במספר דרכים:

  • עבור אריות חדות, כוח אקולוגי גבוה יותר מפחית משיכה אלקטרוסטטית או דחייה בין קבוצות פיראט ו-Silual silanol על השלב הנייח, לעתים קרובות לשפר את צורת השיא ולהפחית את הזנב.
  • כוח איטוני יכול גם להשפיע על מידת הבזבוז של אריות, משנה באופן subtly את ההידרופוביות וההחזקה.

בפועל, ריכוזי buffer בין 10 מ"מ ל 50 מ"מ הם אופייניים.מעט מדי כוח ionic מוביל לצורה גבוהה גרועה עבור בסיסים; יותר מדי יכול לגרום למשקעים או נזק לשאיבה ולחותמות.

Ion-Pair Chromatography

עבור מאוד קוטבי או טעונים כי להראות מעט שימור על עמודות C18 סטנדרטיות, ion-pair reagents להוסיף. ⁇ אלה יש זנב הידרופובי וקבוצת ראש טעון.מודעות הזנב לשלב העמידה, יצירת משטח פסאודו-ion-change. לדוגמה, הוספת tetraylamium ⁇ omium pt (aphobic) כדי לשמור על בשלב ה-buleides, באופן שלילי.

שיטות Ion-pair דורשות שוויון זהיר (לעתים קרובות 10-20 כרכים) ויכולות להיות איטי כדי לחזור על עצמו לאחר ⁇ רץ.ריכוז של יון-pair reagent בדרך כלל נע בין 1 מ"מ ל 20 mM.

לקבלת הדרכה מפורטת יותר על שיטות ion-pair, ראה את ה-FLT:0 [Agilent טכני הערה על ion-pair chromatographyFLT:1]

משתנים נוספים: טמפרטורה, תוספות

בעוד לא רק חלק של הרכב שלב נייד, טמפרטורת העמודה אינטראקציה חזק עם אפקטים של שלב נייד. הגדלת הטמפרטורה מפחיתה את קצב הלבבות של שלב נייד, מורידה את לחץ הגב, ובדרך כלל יורדת שמירה.טמפרטורות יכול גם לשנות את הסלקטיביות, במיוחד עבור תרכובות עם תרומות אנטרופיות שונות לשימור.שיטות מודרניות רבות להשתמש בעמודות מבוקרות מבוקרות כדי להבטיח התחדשות.

כמויות קטנות של תוספים יכולות גם לשפר את צורת השיא או לאפשר מצבי זיהוי ספציפיים:

  • (FLT:0)Trifluoroacetic חומצה (TFAig)FLT:1 (0.05-0.1% v/v) הוא סוכן ion-pairing משותף עבור הפרדה peptide, וגם פועל כמו מאמת נמוך-pH. עם זאת, TFA יכול לדכא אותות ESI-MS; עבור חומצהmic הוא המועדף על LC-MS.
  • (FLT:0)Triethylamine (TEA)cioFLT:1 בריכוזים נמוכים (0.1% v/v) יכול להפחית את זנב לתרכובות בסיסיות על ידי מסכת פעילות סילנול.
  • (FLT:0) TAIRLT:1) לפעמים הוסיף לשלבים ניידים כדי לשליש גלי מתכת שעלולים לגרום לזנבים שיא עבור תרכובות רגישות מתכת מסוימות.

שיטות לפיתוח אסטרטגיות עבור אופטימיזציה של שלב נייד

פיתוח שיטה מודרני לעתים קרובות עוקב אחר זרימת עבודה מובנית למזער את הניסיון-וטרור. נקודת התחלה נפוצה היא להפעיל ⁇ רחבה (למשל, 5–95% B מעל 20 דקות) על עמודה C18 עם ACN כפתרון אורגני. בהתבסס על חלון השימור הצפה, ניתן להעריך יצירה אקוקרטית: לבחור את ה-%B שנותן k' סביב 2-5 לפסגות הראשונות של עניין.

עיצוב ניסויים (DoE)

עבור יותר הפרדה מורכבת, תוכנת DoE יכולה לחקור ביעילות מספר משתנים בו זמנית (למשל, %B, pH, טמפרטורה, ריכוז חיפר). גישה טיפוסית משתמשת עיצוב מורכב ממוקד פנים או עיצוב Box-Behnken עם 15-20 ריצות.מודל פני השטח התגובה צופה תנאים אופטימליים ומצביע על עוצמה.זה חשוב במיוחד כאשר רגולציה דורשת הדגמה של שיטת עמידות.

צפייה בטורים שונים ו- Solvents

אם ההחלטה אינה מספיקה לאחר אופטימיזציה של שלב נייד, הצעד הבא הוא לנסות כימיה של עמודה שונה (למשל, C8, פנול, קוטב-מטב-מטב C18) או מפלט אורגני אחר.

גישה שיטתית מתוארת במדריך הפיתוח של שיטת HPLC, אשר מספק תבניות מעשיות עבור המרה סקלינג-ל-אל-סולקטית.

שיקולים מעשיים ופתרון בעיות

גם עם אופטימיזציה של שלב נייד זהיר, אנליסטים עשויים להיתקל בנושאים משותפים:

  • (FLT:0)Peak tailing:FLT:103) לעתים קרובות נגרמת על ידי אינטראקציות סילנוול עם תרכובות בסיסיות.להגדיל ריכוז חיפר, pH נמוך יותר (עד 3 או מתחת), או להוסיף בסיס מתחרה כמו TEA.
  • (FLT:0) ספירות או שיא כפול: FLT:1 , Indicates לא שלם שווה (במיוחד לאחר ⁇ ), עמודה רִיק, או השפלה חלקית של הדגימה בשלב הנייד.
  • (FLT:0) סחף זמן של קשב: 1FLT בדרך כלל בשל סחף pH, אובדן evaporative של סלנט אורגני, או תנודות טמפרטורה עמודה. Seal בשלב הנייד, השתמש תנור חום טרום-קומימן, ולבדוק טריות בוץ.
  • (FLT:0) גבוה מדכא: 1FLT ניתן לגרום על ידי שלבים ניידים בעלי צפיפות גבוהה (למשל, מים גבוהים עם methanol בטמפרטורות נמוכות) או על ידי משקעים מלח בעת ערבוב חיץ קפוא עם אחוז גבוה של פתרון אורגני.תמיד לערבב שלבים ניידים לפני השימוש וסינון באמצעות 0.45 מיקרומטר.
  • (FLT:0) רעש או סחף: FLT:1 לעתים קרובות מזיהומים UV-absorbing בפתירים או buffers. השתמש ב- HPLC-class פותרים ובמאפים טריים.

מקור: (ב) ,2,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇

מסקנה

ההרכב של שלב נייד הוא הכלי החזק ביותר לשליטה ברזולוציה לאחור-phase HPLC.על ידי התאמה שיטתית של הסוג המפתור האורגני והאחוז, buffer pH ו- ionic כוח, ועל ידי שימוש באופן סלקטיבי בתוספים או ion-pair reagents, אנליסטים יכולים להשיג הפרדה בסיסית אפילו תערובת אנאליות מאתגרות ביותר. A cc מוצק של שמירה הבסיסית - כל תהליך אובייקטיבי, השפעה יעילה על יעילות, פרמטרים, ואפקטים, השפעה יעילה על התפתחות יעילה, השפעה יעילה, פרמטרים, השפעה יעילה, פרמטרים יעילה, פרמטרים, פרמטרים, השפעה יעילה, פרמטרים, פרמטרים של פרמטרים, השפעה יעילה, פרמטרים, פרמטרים יעילה, השפעה יעילה על ידי פרמטרים יעילה, פרמטרים יעילה על מערכת יעילה על בסיס בסיס בסיס יעיל.

ההתקדמות בטכנולוגיית עמודה, אופטימיזציה מונחה תוכנה, וכלי כלי חזק הפכו אופטימיזציה של שלב נייד לנגיש יותר מאי פעם.עם זאת, העקרונות הבסיסיים נשארים ללא שינוי: תשומת לב זהירה להכנה של שלב נייד, בקרת pH, ואיכות פתרון חיוני להשגת הפרדה הדדית יעילה, גבוהה ברזולוציה גבוהה יום לאחר יום.

בין אם עובד במעבדה QC של ציוד גבוה או לפתח שיטה ביואנליטית חדשה, להשקיע זמן בהבנה ושליטה של שלב נייד הרכב משלם דיבידנדים באיכות נתונים, עמידות שיטה, ופרודוקטיביות לטווח ארוך.