החלת טכנולוגיית קריספרו כדי לשנות תאים בתרבות למטרות מחקר

מבוא ל-CRISPR-based Cell Engineering

הופעתה של טכנולוגיה מגובשת באופן קבוע חוזר קצר פניות (CRISPR) הטכנולוגיה שינתה באופן יסודי את האופן שבו חוקרים מניפולטיביים את הגנום של תאים תרבותיים. על ידי מתן ביצועים מדויקים, ניתן לערוך כמעט בכל מקום בגנום אקולוגי, מערכות CRISPR מאפשרות למדענים ליצור קווי תרבות אדגנטיניים יותר, לבצע מסכים גנטיים פונקציונליים, ולבנות מודלים מדויקים של מחלה בתבל שלא כמו פלטפורמת CRIS-חול, כלומר, כדי ליישם את הכלים הדרושים יותר, כמו גם יותר, כדי ליישם את ה-מוח, כדי ליישם את ה-מוח, כדי ליצור תבניות ניתוח תאים פשוטים יותר, קריפטוגניים יותר, קריפטוגניים יותר, כגון: CIS, כדי ליישם את ה-מוח, כדי ליצור תבניות פונקציונליות יותר, כדי ליישם את הגדלים יותר, כדי ליישם את ה-קולאריכים פשוטים יותר, כדי ליישם את הגדלים יותר, כדי ליישם את ה-קולאריכים פשוטים יותר, כדי ליצור כיום, כדי ליצור כיום, כדי ליישם את ה-קולאריכים מתקדמים יותר, כדי ליצור כיום, כדי ליצור תבניות פונקציונליות יותר, כדי ליישם את ה-קולאריכים פשוטים יותר, כדי ליצור תבניות פונקציונליות יותר, כדי ליישם את לוחות סטנדרטיות תאים פשוטים יותר, כדי ליישם את לוחות

מאמר זה מספק סקירה טכנית מקיפה של יישום CRISPR כדי לשנות תאים תרבותיים.We מכסה את רכיבי הליבה של CRISPR-Cas9, פרוטוקולים מפורטים למשלוח ובחירת, אסטרטגיות עריכה מתקדמות, מלכודות נפוצות, וחידושים מתעוררים כי הם דוחפים את השדה קדימה.המטרה היא לתת לחוקרים חדשים ומנוסים מדריך מעשי, ייצור מוכן לשימוש CRIS בזרימות העבודה התא שלהם.

תוצאות חיפוש > CRISPR-Cas9

(ה- CRISPR-Cas9 מורכב משתי מולקולות חיוניות: Cas9 endonuclease ומדריך יחיד RNA (sgRNA) sgRNA מכיל רצף של 20nucleotide אשר משלים לאזור הדנ"א היעד, ואחריו רצף סקופי (RDS) אשר מדביק את Cas9 לחתכים, ה-DNA המטרה חייב להיות מיד לאחר מוטיב קצר ל-fctomcto) לאחר מכן (Fgstero-mgster) לאחר מכן, כאשר הוא אחד מהם הוא אחד הוא אחד הוא אחד הוא אחד (RDXD) ו-DNUMDNUMDNUMDNUMDNUMDXD) עבור CROMDXD 9D 9D 9D) עבור CROMD 9D 9D 9DXD 9D) עבור CROMD 9D 9D 9.

החוקרים יכולים לעצב sgRNAs באמצעות כלים כגון:0 (CHOPFIRLT:1) כדי למקסם את פעילות ה-target ולמזער פוטנציאל ה-DSB מתוקן על ידי אחד משני מסלולים אנדוגניים: לא הומולוגית סוף הצטרפות (NHEJ), אשר הוא שגיאה-prone ומציג אסטרטגיה קטנה או דה-לטים (indels) שיכולה להתאים את הפונקציה המדויקת או לתקן את ה-HDR).

שם הסרטון: Knockouts and Indel Mutations

עבור רוב המחקרים אובדן תפקוד, NHEJ הוא המסלול המועדף. על ידי מתן Cas9 ו sgRNA מיקוד קידוד reding exon, החוקרים ליצור תערובת של להקות הגורם שינויים או הפסק מוקדם להפסיק codons. לאחר תקופת התאוששות, תאים הם יחיד-תאים יחיד שיבוט ורצף כדי לאמת את הדפקעת.

HDR: Knockins and Precise Modifications

כאשר נדרש שינוי מדויק - כגון הוספת תג פלורסנט, מוטציה נקודה או אלש מותני - HDR הוא מועסק.יעילות HDR בקווים תאים אלמוות הוא בדרך כלל נמוך (1–10%) ודורש שיתוף פעולה של תבנית התורם.התור יכול להיות יחיד סטרונקיט (sODN) עבור עריכת קטן או abalusa-abn-upy של תבנית מבוססת על ידי שימוש בתאים גדולים יותר.

מתן פיצויי CRISPR לתאים תרבותיים

ההצלחה של ניסוי CRISPR תלויה במידה רבה במשלוח יעיל של חלבון Cas9 ו sgRNA לתוך גרעין.מספר שיטות זמינים, כל אחד עם יתרונות ומגבלות. הבחירה תלויה בסוג תאים, תקציב, ורצון דרך חישוב.

« « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « «

ליפיפיפיון משתמשת ב reagents ליפיד שפתיים כדי ליצור קומפלקסים עם plasmid DNA ⁇ Cas9 ו sgRNA. זה פשוט ועובד היטב עבור קווי קל-ל-ל-ל-transfect כגון HEK293T, HeLa, וקווים רבים של תאי סרטן.עם זאת, ליפיפיפיפון הוא פחות יעיל עבור תאים ראשוניים, ותאי השעיה.

אלקטרופורציה

אלקטרופורציה מתייחסת לדופק חשמלי קצר כדי לחדור באופן transiently permeabilize את תא membrane, המאפשר DNA, RNA, או RNP מורכב כדי להיכנס.מערכות מודרניות כמו Lonza Nucleofector או Thermo Fisher Neon מציעים יעילות גבוהה אפילו בתאים קשים ל-transfect, כולל תאי גזע בשפע (iPSC) ו- 24 אלקטרופורמולים (C) ו- 9) הוא בעיקר לתאים מורכבים של חלבון טרמפנזיום (C) - 9) ו-C) הוא סיכון גבוה (C) - 948 (C) -2, במיוחד ל-C) ו-C) TRADRMS (C) ו-C) הוא יעיל יותר (C) ו-C) ו-C) TRADMAC) TRADRMS (DREDVSTDREDREDV (DVSTDRED) במיוחד ל-C) במיוחד עבור תאים מורכבים (DRM-C) ו-RPTS (DPTS (C) ו-RPTS (C) ו-C) ו-RPTS (DPTS (החליטה-C) ו-DRM-

וקטורים ויראליים

עבור תאים כי הם refractory to Transfection, Transduction ויראלי מספק אלטרנטיבה אמינה. .Lentiviral וקטורים יכול לשלב Cas9 ו sgRNA ביטוי casettes, מה שהופך אותם אידיאלי עבור מסכי CRISPR מוכנס. Adeno-compciated virus (AAV) וקטורים משמשים גם עבור משלוח של תבניות התורמות בניסויים HDR, למרות יכולת האריזה שלהם מוגבלת (kמאובטחים) עבור חוקרים פוטנציאליים.

שיטות מבוססות מיקרו- חלקיקים ו-Nanoparticle

מיקרו-זרקון הוא כוח-העבודה, אך יכול להשיג דיוק תאים יחיד, לעתים קרובות בשימוש עבור zygote עריכת בייצור בעלי חיים טרנסגני. לאחרונה, חלקיקים ליומנים וננו-חלקיקי זהב פותחו עבור משלוח transient של Cas9 mRNA ו sgRNA, המציע אלטרנטיבה לא-ויראלית עם immunogenicity.

בחירת, Enrichment ואימות של תאים מזוינים

לאחר הלידה, רק תת-קבוצה של תאים תישא את האסטרטגיות הרצויות לעריכה, חיוני להשיג אוכלוסייה טהורה בניסויים במורד הזרם.

כתבים פלואורסנט ו- FACS

כולל עיתונאי פלואורסנט (למשל, GFP או BFP) ב- עריכת סקאקט או באמצעות co-delivery של סמנן פלואורנט נפרד מאפשר FACS לבודד תאים שונו בהצלחה.עבור דפקינים HDR, תאים ניתן למיין בהתבסס על ביטוי של תג פלורסנט, מאוד מאיץ בידוד.

בחירת אנטיביוטיקה

אם גן התנגדות של puromycin, פיצוץ, או ניאומיצין מוצג, הברירה אנטיביוטיקה יכולה להעשיר במהירות עבור תאים מעודכנים.עם זאת, שיטה זו אינה מבחין בין תאים המשולבים את הגן ההתנגדות בנקודת היעד לעומת אירועי אינטגרציה אקראיים, כך נדרשת אימות נוסף.

כוונון ואימות

יש צורך לבצע טיעונים מועמדים באמצעות PCR, Sanger Sequencing, או הדור הבא של ריצוף. עבור משובי דפק, שילוב של ריצוף ברחבי האתר לחתוך ונפיחות מערבית לאובדן חלבון מומלץ. עבור דפקינים, לטווח ארוך PCR המשתרע על פני שתי זרועות הרציחות יכול לאשר שילוב נכון, וריצוף יכול לשלול צומת יכול לשלול התנגשויות בצומת בתיקון בצומת.

יישומים של תאים CRISPR-Modified במחקר

מגוון השאלות הניסוייות שניתן לטפל בהן באמצעות תאים מתוכנתים CRISPR הוא עצום.כאן אנו מדגישים מספר אזורי מפתח.

סיקורים גנום פונקציונלי

מסכי CRISPR פולסים משתמשים בספריות entiviral המכילות אלפי sgRNAs כדי לדפוק באופן שיטתי כל גן בגנום.לאחר בחירת פנוטיפ (למשל, הישרדות תאים תחת טיפול תרופתי או התנגדות לזיהום ויראלי), ריצוף עמוק של sgRNAs משולב מזהה גנים החיוניים לתהליך. גישה זו הייתה אינסטרטיבית בגילוי חדש של פרצות סרטן, תשובות מארחות עבור גורמים חיסוניים, וגורמים של s.

מחלות עם קווים תאיים איסגנטיים

על ידי הצגת מוטציות ספציפיות לחולה לקו תאים שליטה, החוקרים יוצרים מודלים אגוגניים השוונים רק במוטציה של עניין.זה מבטל את ההשפעות רקע גנטיות ממצאות, למשל, הצגת ה-FLT:0 (BRCA1FLT:1 185delAG לתוך MCF10A חזה אפיתל מאפשר מחקר מדויק של איך שינויים בודדים משפיעים על תיקון DNA וגידולים של HIV, באופן דומה ניתן לתקן חולים.

CRISPR Interference and Activation (CRISPRi/a)

באופן קטליטי מת Cas9 (dCas9) ממוזג למדכאים מטושטשים (למשל, KRAB) או פועלי פעולה (למשל, VP64) מאפשר שינוי ביטוי גנים ללא חיתוך ה-DNA. CRISPRi יכול להשתיק גנים עם מפרט גבוה, בעוד CRISPRa יכול להרים גנים אנדוגניים.

קואג'ה Tracing and Barcoding

על ידי מתן ספריית רצפי ברקוד ייחודיים באמצעות HDR לתוך כיכר נמל בטוח, החוקרים יכולים לעקוב אחר הדינמיקה של אוכלוסיות תאים לאורך זמן.טכניקה זו, המכונה CRISPR קידוד או CarLIN, מגלה כיצד תאים בודדים תורמים להפרדה, metastasis, או עמידות לסמים.

אתגרים ומלכודות טכניות

למרות כוחו, עריכת CRISPR בתרבות התאית אינה ללא קשיים.הכרה וצמצום האתגרים הללו הוא קריטי לתוצאות ניתנות להתחדשות.

השפעות Off-Target

Cas9 יכול לסבול פגמים בניתוח sgRNA:DNA דופלקס, המוביל לערוך unintended במקום אחר בגנום. Off-target מוטציות יכול לנבא ניתוח phenotypic ו mislead בניסויים הזרם.אסטרטגיות למזער תופעות מחוץ לטרגן כולל באמצעות נטיות גבוהות Cas9 (למשל, eSpCas9, Spcas-9, מיקוד אתרים ניסיוניים, ריצוף עם ציונים ספציפיים, RNA עם ציונים גבוהים יותר, RNA.

HDR נמוך

HDR הוא לעתים קרובות לא יעיל, במיוחד בתאי חלוקה לא-דיויד או לאט, כי זה דורש תבנית התורם ומכונת recombination פעילה הומולוגית פעילה.כדי לשפר את HDR, החוקרים יכולים לסנכרן תאים בשלב S באמצעות מעכבים כימיים (למשל, nocodazole), להשתמש במולקולות קטנות המדכאות את NHEJ (למשל, SCR7 או DNA-PKK), מעכבות חלבון מורכב.

פסיפס וריאציות קלונאליות

גם לאחר שיבוט תאי יחיד, לא כל התאים באוכלוסייה עשויים לשאת את אותו עריכה בשל ביטוי ממושך של Cas9 או תיקון מתמשך.זה בעייתי במיוחד בתאי גזע.הגבלת ביטוי Cas9 ל דופק קצר (באמצעות אספקת RNP או מערכות בלתי ניתנות לחינוך) מקטין פסיפס.בנוסף, אימות זהה זהיר של מספר שיבוטים עצמאיים מומלץ להבטיח pheyplexency.

שקיפות ועומס אספקה

Transfection, אלקטרופורציה, ו Transduction ויראלי יכול לגרום לתגובות לחץ סלולרי, כולל DNA נזק אותת ואפופטוזיס.שימוש בפרוטוקולים ממוטבים, צמצום כמות של חומצה נוקלית נמסרה, ומאפשר זמן התאוששות נאותה יכול לשפר את בריאות התא.עבור סוגים רגישים כמו תאי גזע ראשוניים או hematopoietic, RNP מבוסס משלוח עם תנאי אלקטרופורציה עדינה הוא לעתים קרובות מועדפים.

שיקולים אתיים והמשפטיים

בעוד שתאים עריכת בתרבות למחקר בסיסי נופל תחת הנחיות ביו-בטיחות מוסדיות סטנדרטיות ו DNA רב-תכליתי, כמה ממדים אתיים מציינים את תשומת הלב.כאשר תאי גזע אנושיים או תאי גזע עובריים משמשים, פיקוח נוסף מוועדות פיקוח תאי גזע עשוי להיות נדרש. Somatic Cell העריכה עבור יישומים טיפוליים פוטנציאליים חייב לדבוק בתקנות ה- FDA ו- EMA.Grmline - שינוי ביצים, עובריים, או עובריים, או מעלה - כרגע, מבטיח כי הם לא רלוונטיים, ולא משתמשים בדאגות אחראיות של מחקר קריטיים, ולא אחראיים, נכון לעכשיו, אך ורק על ידי חוקרים אחראים.

כיוונים עתידיים וטכנולוגיות מתפתחות

שדה CRISPR ממשיך להתפתח במהירות.למטה הם התפתחויות מפתח המבטיחות להרחיב עוד יותר את היקף עריכת התרבות התאית.

בסיס עריכה

עורכי בסיס ממזגים את Cas9 פגום קטליטי (ניקאז) לאנזימים דהאמינצ'ז, המאפשר המרה ישירה של זוג בסיס אחד לשני (למשל, CforT או AMCG) מבלי לדרוש DSB או תבנית התורם. טכנולוגיה זו אידיאלית לחיקוי מוטציות נקודתיות ותיקון SNPs פתוגניים בקווים עם יעילות גבוהה ומינימום על ידי מוצרים.

עריכה

עריכת ראש משתמשת Cas9 nickase מפוחדת לתרגום לאחור, יחד עם מדריך עריכה ראשונית RNA (pegRNA) הנושא את העריכה הרצויה.זה יכול להציג התערבויות, מחיקה וכל 12 המרות בסיס אפשריות עם מעט מאוד מחוץ ל-target עורכים.למרות משלוח בתרבות התא הוא מורכב יותר, עריכת ראשוניים צובר במהירות אימוץ לשינוי גנטי מדויק.

ב-Viovo Editing and Organoid Models

מספר הולך וגדל של מחקרים הם החלים CRISPR ישירות תאים בתוך אובריונים או על ידי הזרקת רכיבי עריכה לבעלי חיים חיים.לדוגמה, משלוח של רכיבי CRISPR באמצעות AAV לתוך הרשתית או הכבד של מודלים עכברים מאפשר תיקון של פגמים גנטיים (FLT:0in situFLT:1 שילוב CRISPR עם מערכות תרבות 3D אוברידי מספק פלטפורמה רלוונטית יותר עבור חקר ומחלות.

ביולוגיה סינתטית ו-Synthetic Biology

באמצעות מספר רב של sgRNAs בו זמנית, החוקרים יכולים לערוך כמה גנים בבת אחת, המאפשרים בנייה של מעגלים גנטיים סינתטיים או מודל של מחלות פוליגניות.מערכות כמו MAD7 (Cas12a) nuclease, אשר מעבד את מערך CRISPR שלה, לפשט מספרxing.בנוסף, CRISPR ניתן להשתמש כדי לשלב אשכולות גנטיים גדולים לתוך בטיחות הנמל, פתח את הדלת לתכנות עבור התנהגות ביולוגית.

שיקולים של פרוטוקול מעשי

כדי ליישם את עריכת CRISPR בתרבות התא, אנו ממליצים על זרימת העבודה הבאה:

1. עיצוב 3-5 sgRNAs למטרה באמצעות אלגוריתמים חיזוי מותאמים (ראה:0Doench et al., Nature Biotechnology, 2016FLT:1).
2. Clone sgRNAs לתוך וקטור ביטוי (למשל, lentiCRISPRv2) או לרכוש sgRNAs סינתטית שונה מבחינה כימית.
3. לספק Cas9 ו sgRNA דרך השיטה המתאימה ביותר עבור סוג התא שלך (RNP אלקטרופורציה עבור תאי גזע; plasmid lipofection עבור HEK293T).
4. אפשרו 48-72 שעות לעריכה, ואז לקצור DNA גנומי ולבצע T7E1 או סקרר כאומר להעריך יעילות עריכה.
5. תאים דחוסים עשירים באמצעות סימון בחירה מגובש או FACS, ולאחר מכן תאים בודדים לתוך 96 הצלחות דיוול.
6. משובי מסך של PCR ו- Sanger, ובחירת לפחות שני טיעונים עצמאיים לאימות phenotypic.
7. אישור על עריכת target ובדוק העליון מחוץ לאתרי ריצוף הדור הבא.

פרוטוקולים מפורטים זמינים מ-FLT:0 [המרכזים של CRISPR], המציעים plasmids, פרוטוקולים, ומדריכי פתרון בעיות.עבור מסכים גבוהים, פלטפורמת ההסתה הגנטית של המכון הרחב מספקת FLT:2pre-oriented sgRNA ו- Analysis Tools.

מסקנה

טכנולוגיית CRISPR הפכה כלי חיוני לשינוי תאים בתרבות, המאפשר לחוקרים למחוץ את תפקוד הגנים, מודל מחלות אנושיות עם דיוק חסר תקדים, ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות. על ידי תכנון בקפידה של sgRNAs, בחירת שיטות אספקה מתאימות, ואימות קפדני של שיבוטים עריכת קפדני, מדענים יכולים למנף את מלוא הפוטנציאל של CRISPR כדי לקדם גילוי.