מבוא

ניתוח סמנים גנטי מסתמך על מגוון רחב של דיסציפלינות מדעיות, מאבחון קליני ורוקחים כדי לזהות משפטית וביולוגיה אבולוציונית. על ידי בחינת רצפי DNA ספציפיים או דפוסי וריאציות, החוקרים יכולים לזהות את כלולים הקשורים למחלות, לאמת מערכות יחסים משפחתיות בשילוב עם נתונים שונים, ולעקוב אחר ההיסטוריה של כלי ניתוח זה תלוי במידה רבה על הפרדה וגילוי טכנולוגיות המועסקות ביותר הם אלקטרו-ידי פעולה מקיפה (HP) על ידי שיטות ריצוף יחיד (Ricial) ו-Scurephicials) על ידי שימוש בטכניקות שונות, ו-HPDemeksociulrephsivesivesicials (Ricials) על ידי ניתוח יחיד (Ricials) על ידי ניתוח יחיד (Ricialssociulreidation) על ידי כל שיטות ניתוח יחיד (Ricials) על ידי ניתוח יחיד, ו-emtexates) על ידי ניתוח יחיד (Remtexates (Remciulreidation) של כל שיטות ניתוח נתונים שונים, ו-S (Remciulresociulemtexitation) על ידי ניתוח נתונים, ו-ידי ניתוח יחיד (HP) כדי לספק את כל שיטות

Capillary Electrophoresis ב-גנטיקה Marker Analysis

עקרונות של אלקטרופורזה Capillary

Capillary אלקטרו-RNA מפרידים את האשם תחת השפעת שדה חשמלי בתוך קפילות מפואר צר-סוי (בדרך כלל 25-100 מיקרומטר פנימי) ה- capillary מלא פתרון buffer מוליכים-פעמי אשר pH ו- Ionic ניתן לכוון לאופטימיזציה של הפרדה.

עבור יישומים גנטיים, capillary הוא לעתים קרובות מלא עם מטריקס פולימרי אחב (למשל, פולי אקרימיד ליניארי או פוליאתילן תחמוצת) שמפרידה שברים DNA בגודל. שברירים קטנים יותר נודדים מהר דרך רשת זיהוי פולימרים, בעוד שברים גדולים יותר מבוצעים בדרך כלל על ידי פלואורדיזציה מושרה לייזר (LIF) באמצעות צבעים בין-סטרים או שברים חיוניים של תאים כגון סגסוגת יחידית (סימולטים) יכולות מיקרוסקופית אחת, כגון סלקת יחיד.

Instrument and Workflow

מכשירים מודרניים לסה"נ לניתוח גנטי (למשל, יישומי Biosystems SeqStudio, QIAgen QIAxcel) משלבים מספר רב של capillaries (8, 16, 24, או 96) כדי לאפשר עיבוד מקביל של דגימות. רכיבי מפתח כוללים אספקת חשמל גבוהה מתחולל, מערכת זריקות דגימות (אלקטרוני הידרודינמיקה), קפילארי תרמוסטט, ודגמי שפעת, לאחר מכן הם גבהים אלקטרוגרפיים אמיתיים (D) בהתאמה לרמה).

זרימת עבודה טיפוסית לניתוח microsatellite כרוך: (1) PCR amplification של ⁇ המטרה באמצעות פלואורסנסנטים מתוייגים באופן משמעותי ראשוני, (2) dilution של מוצר PCR, (3) ערבוב עם גודל סטנדרטי וצורהamide, (4) decortion at 95 מעלות צלזיוס, (5) קירור מהיר על הקרח, ו- (6) לתוך המכשיר CE ניתוח נתונים קורא אוטומטית כל השלד ו-Fiifies בפסגות, לעתים קרובות, לוקח פחות מ- 30 דקות.

המונחים: Genetic Marker Analysis

DNA רגיש

CE הוא עמוד השדרה של ניתוח קצר סנסציוני חוזר (STR) מעבדות ברחבי העולם להשתמש ערכות מבוסס CE (למשל, PowerPlex, GlobalFiler) כדי להרחיב ולפריד 15-24 ליטרים פלוס סימן מין.הכוח המפלה גבוה (>1 ב 10FLT:018FLT:1 עבור אנשים שאינם קשורים) בשילוב עם רזולוציה בודדת של DNA, מאפשר גם לאבחון DNA יעיל של DNA.

גילוי קליני

CE הוא מיושם באופן שגרתי על המסך עבור מוטציות בגנים הקשורים למחלות.לדוגמה, בסיציקי פיברוזיס, ניתוח שבר מבוסס CE מזהה מוטציות CFTR נפוצות על ידי התבוננות בשינויים בגדלים שונים לאחר הגבלת העיכול או באמצעות שימוש ב- מרובותx ligation-תלויה בדיקה amplification (ML) incology, CE משמש לזיהוי של חוסר יציבות מיקרוסול (MS), מספר של סרטן קצה ומחזורי של סרטן כמותי (D) כגון סימניות).

Genotyping ו-SNP Analysis

בעוד שמערךי SNP בעלי ערך גבוה, CE נשאר בעל ערך עבור נמוך ל-medium באמצעות genotyping, במיוחד במעבדות קטנות או למחקרי אימות.טכניקות כגון הרחבה בסיסית יחיד (SBE) ואחריו הפרדה CE יכול לחקור מספר רב של SNPs ב capillary יחיד. בדומה, CE יכול להפריד את כל מוצרי PCR ספציפיים המבוססים על התווית שונה סוג גנטי, המשמש לדגימות של CE עבור יבולים חד-בקר.

יתרונות ומגבלות

CE מציעה מספר יתרונות: רזולוציה גבוהה (עד 1 bp), דרישה קטנה של נפח מדגם (1-10 nL זריקת nL), זמני ניתוח קצרים (10-30 דקות לריצה), והתאמה לאוטומציה.הגבלות כוללות את הצורך בלייבל פלואורסנט (עלויות מהדהדות), ההזרקה אפשרית עם הזרקת אלקטרוקינזית, ואת הדרישה לתחזוקה זהירה ובטיחות פולימר כדי למנוע קידוד, עבור יישומים מדויקים של 50 ק"מפוסים, למרות זאת, הדורשים של בחירה.

שיטות Chromatographic לניתוח גנטי

High-Performance נוזל Chromatography (HPLC)

HPLC מפריד מולקולות המבוססות על חלוקה שונה בין שלב נייח (עמודה ארוזה) לבין שלב נייד (Liquid Solnt) תחת לחץ גבוה.עבור ניתוח גנטי, הפוך HPLC (RP-HPLC) הוא הנפוץ ביותר, שבו השלב הנייח הוא הידרופובי (למשל, C18) והשלב הנייד הוא תחנת מים-איקלל, במיוחד על ידי LCCRM-COC.comic-C.

IP-RP-HPLC מפריד בין שברים דנ"א בגודל (עם רזולוציה גבוהה יותר עבור שברים קטנים < 200 bp) ויכול גם להפריד שברים של אורך זהה שונים ברצף (למשל, יחיד-סטרולציה תואם פולימורפילים) זיהוי UV (260 nm) או גילוי פלואורסנס (באמצעות צבעים או פרימנטרים מתוייגים) משמש.

הכחשת HPLC (DHPLC)

הכחשת HPLC היא טכניקה מיוחדת לגילוי מוטציות.זה עובד על ידי חימום הדגימה כדי להסיט חלקית heteroduplexes שנוצרו בין טיפוס פרוע ומוטאנט DNA סטרנדים.ה heteroduplexes יש טמפרטורות נמוכות יותר היתוך וערפל מוקדם יותר מאשר הומודופלקסים מושלמים על עמודה נשמר בטמפרטורה מסוימת (בדרך כלל 50-70 מעלות צלזיוס) DHP יכול לזהות מוטציות קטנות ו-95 לא ידוע עם מוטציות קטנות (לא ידוע עם מוטציות או ירידה).

גודל-Exclusion Chromatography ו- Affinity Chromatography

גודל-exclusion chromatography (SEC) מפריד שברים DNA בעיקר על ידי גודל והוא משמש לעתים קרובות לניקוי מוצרי PCR או לניתוח אינטראקציות חלבון DNA-חלבון. Affinity chromatography, באמצעות בדיקות DNA המושתתת בשלב הנייח, יכול להעשיר רצף ספציפי (למשל, methylated DNA או אתרי קידוד) מתערובת מורכבת אלה וטכניקות להשלים את CELC.

המונחים: Genetic Marker Analysis

ניתוח DNA Methylation Analysis

HPLC יחד עם ספקטרום המוני של ספקטרום (LC-MS) הוא תקן זהב עבור לכמת methylation גלובלית (למשל, 5-methylcytosine רמות) לאחר הידרוליטיקה DNA לnucleosides, RP-HPLC מפריד את קצב הניקוזידים המשתנים, ו-MS מודד את יחס המסה-ל-לטעון, המאפשר זיהוי מוחלט של גישה זו משמשת סרטן, אפילמטי, מחקרים התפתחותיים, הזדקנות וביולוגיה.

גילוי של DNA Adducts ו-Oxidative damage

HPLC-UV או HPLC-fluorescence יכול לזהות תוספות DNA שנוצרו על ידי חשיפה ל- carcinogens כימיים או מינים חמצן תגובתיים. על ידי ניתוח זמני שימור אופייני ו-spectra, החוקרים יכולים לזהות כתמים ספציפיים ולכמת את השפע שלהם. סמנים אלה משמשים הרעילולוגיה ומחקרי בריאות סביבתיים.

אולטגונוקלוריד פוריות ושליטה איכותית

בסנתזה של בדיקות וראשי התיבות לניתוח גנטי, HPLC חיוני לאמת טוהר. RP-HPLC יכול להפריד מוצרי סינתזה לא שלמים, להגן על oligonucleotides, ותוויתי פלואורסנט מהמוצר באורך מלא. טוהר גבוה הוא קריטי עבור אמין PCR ו אסימונים היברידיים.

יתרונות ומגבלות

HPLC מציעה התחדשות מצוינת, היכולת להתמודד עם נפח הדגימה גדול (μL ל- mL), והתאמה עם מגוון רחב של מצבי זיהוי (UV, פלואורסנס, MS) זה לא דורש תווית פלואורסנט עבור יישומים רבים (למשל, זיהוי UV לניתוח ניוקלוסייד).

שימוש סינרגי של Capillary Electrophoresis ו Chromatography

חיזוקים

Capillary אלקטרופוזה ו chromatography לספק מידע משלים על סמנים גנטיים. CE מצטיין בניתוח מהיר ורזולוציה גבוהה של שברים DNA בטווח 50-1000 bp, מה שהופך אותו אידיאלי עבור ניתוח סטרוטציה, microsatellite ניתוח, ואנליזה מבוזרת של טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם ניתוח קיסרי. Chromatography (במיוחד IP-HP-HP-LC) מציעה הפרדה מעולה של שינויים קטנים של מהירויות, המאפשרים, כולל, כמו גם מהירויות שונות, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר, כמו גם טוהר ניתוח.

אינטגרציה לדוגמא

זרימת עבודה משולבת טיפוסית לניתוח גן מועמד עשוי להימשך כדלקמן: (1) לחלץ DNA גנטי מדגימות המטופל. (2) להגביר את פיזור היעד על ידי PCR.(3) Analyze PCR גודל וריכוז על ידי CE (באמצעות DNA 1000 שבב על מדבקה ביואנליזת תאית DMC) כדי לאשר את ההדגמה והעדר של מוצרים שאינם ספציפיים. (4) לבצע בדיקת DLC של מוטציות יקרות (תמספק זיהוי מוטציות) כדי לאשר את מוטציות המכילות מוטציות (אפקטים כימיים).

עבודות חירום

במעבדות לחישה, CE הוא הכלי העיקרי עבור פרופיל חיצוני, אבל chromatography יכול לשחק תפקיד תומך. לדוגמה, כאשר עובד עם דגימות מוזנח או מעכב, HPLC ניקוי (באמצעות עמודות ספינים או ה-SEC) יכול להסיר מעכבי PCR (למשל, חומצות לחות, hematin) לפני ניתוח CE. לחלופין, אם דגימות מכילות תערובת של DNA מכמה אנשים יכולים לפשט סימולציות, יותר, כלומר, כדי לפשט יותר מ- DNA, כדי לפשט יותר מ-ixixiOSD.

פרוטוקולים אבחון קליני

בגנטיקה קלינית, CE ו- HPLC משמשים לעתים קרובות כ-SEIN.לדוגמה, בבדיקת תינוקות לתנאים כמו immunodeficiency משולב חמור (SCID), CE מודדת מעגלים של קולטני תאי T (TRECs) כסמן של הפלט האתמי.HPLC משמש כדי לאשר את הממצאים על ידי מדידה של פעילות דלקת מפרקים או metalaxinebolites.

סינרגיות מתפתחות: CE-MS ו-HPLC-MS

Coupling CE או HPLC עם ספקטרומטריה המונית מגביר את הכוח האנליטי שלהם. CE-MS צובר מתח עבור metabolomics ו proteomics אבל הוא פחות נפוץ עבור ניתוח דנ"א ישיר בשל אתגרים ionization. עם זאת, ניתוח של שינויים DNA (למשל, 5-hydroxymethylcytosine), HP-LC /MS / נשאר שיטת הבחירה, מתן שינוי וזיהוי שיטות פעולה עבור בדיקות גנטיות לאחר מכן יכול להיות יעיל יותר עבור התקנים לא ידוע.

שיקולים מעשיים ובחירת שיטות

גורמים המשפיעים על הבחירה

הבחירה בין CE ו- HPLC תלויה בסמן הגנטי הספציפי, בדגום באמצעות חישוב, מגבלות עלות ותשתית זמינה.

  • (FLT:0) מהו טווח הגודל של ה-Virtualtes?BuildFLT) 1 עבור קטעים בין 50 ל 1000 bp, CE הוא בדרך כלל מהיר יותר ורזולוציה גבוהה יותר. עבור oligonucleotides קטן יותר או nucleosides, HPLC (במיוחד IP-RP-HPLC) מספק הפרדה טובה יותר.
  • (FLT:0) האם מולקולות היעד מושמות?FLT:1 CE עם LIF דורשות תוויות פלואורסנט.HPLC עם זיהוי UV יכול לעבוד ללא תוויות, אך הרגישות נמוכה יותר.
  • (FLT:0) האם יש צורך בהפלה?(FLT:103) עם UV או MS מציע כימות חזקה ללא סטנדרטים פנימיים עבור כל פיראטה. CE, הקוונטים יכול להיות משתנה יותר בשל ההטיה ההזרקה.
  • (FLT:0) האם בדיקת מוטציות נדרשת?FLT:1 dHPLC תוכנן במיוחד למטרה זו והוא יעיל עבור סריקה של אזורים גדולים. CE יכול גם לזהות מוטציות באמצעות יחס משתנה או פלואורסנט גודל, אבל עם פחות באמצעות חישוב.
  • (FLT:0) מה הם דרישות הרגולציה?FLT:1eur עבור יישומים קליניים או משפטיים, גלגולי עבודה מאומתים (למשל, CE עבור מנגנונים) נדרשים.

בקרת איכות וסטנדרטיזציה

שתי הטכניקות דורשות אמצעי בקרה איכותיים חזקים.ניתוח CE צריך לכלול סולמות אלקליות, סטנדרטים פנימיים בגודל ובקרות חיוביות / שלילי עבור כל ריצה.שיטות HPLC צריכות שוויון עמודה, בדיקות התאמת המערכת (למשל, שמירה על זמן שיפור, סימטריה שיא), ושימוש בחומרי התייחסות מוסמכים.

כיוונים עתידיים

חידושים טכנולוגיים ממשיכים לשפר את היכולות של CE ו- HPLC לניתוח גנטי.microfluidic CE (lab-on-a-chip) לשלב הכנת דגימות, PCR, והפרדה על מכשיר יחיד, צמצום זמני הניתוח עד דקות וספירת דגימות nanoliters. מכשירים קרול CE מפותחים עבור בדיקות גנטיות בשלב טיפול בשלב מסוים בתנאי שדה.

השילוב של CE ו- HPLC עם הדור הבא של זרימת העבודה (NGS) הוא מגמה נוספת. CE ניתן להשתמש עבור בקרת איכות של ספריות NGS (השינג ו- קוונטיזציה), בעוד HPLC יכול לטהר גדלים ספציפיים לפני ריצוף. במחקר אפיגנטי, HPLC-MS נשאר תקן הזהב לניתוח מבוסס בסיס, בעוד שיטות מבוססות CELC הן מתפתחות עבור ניתוח חד-חמצני מהיר, באמצעות שילוב של שיטות ניתוח גנטי עמוק יותר.

מסקנה

Capillary אלקטרופוזה ו chromatography הם כלים יסוד בניתוח סמנים גנטי, כל אחד מציע יתרונות ייחודיים. CE מספק מהירות ופתרון ללא מקבילים עבור פיצול DNA, מה שהופך אותו הכרחי עבור טיפוסים משפטיים, קידום גנוטיפטציה קלינית וגילוי מוטציות. Chromatography, במיוחד HPLC בצורות שונות שלה, מספק הפרדה חזקה של oligocleotot, שינויים שינוי nucleides, מאפשר ⁇ חומרים אלה, כדי לפתח את התכונות הכימיות, כדי לפתח את הגמישות ניתוח חומרים מתקדמים, במיוחד.