Table of Contents

נזק קרטליג הנובע מטראומה חריפה או ממחלות ניווניות כגון אוסטאוארטיס נשאר אחד הבעיות המשכנעות ביותר ברפואה אורטפיליתית. כי מחסור בדלקת מפרקים אינטריאנית ואוכלוסיית תאים פרוגנרית חזקה, הוא מציג יכולת מוגבלת של התערבות עצמית-מסוגית - החל ממיקרו-קריפטומטית ומחולקת-טיפולים לזמינות גבוהה (מתאים) של מספר זה, בעיקר על ידי תאים מפונקטיביים-מתאים מפונקטיביים-מתאים , אשר לעתים קרובות, על ידי אפקט סטנדרטיים-מתאים מפונקטיביים-מתאים מפונקטיביים (מתאים מצופה).

מה הם Microcarriers? Structure, Materials, and Design Principles

מיקרוקררים הם beads spherical או cylindrical, בדרך כלל החל מ -100 עד 300 מיקרומטר בקוטר, המשמש כמריצה תמיכה עבור תאים עצמאיים העוגן.הם מיוצרים ממגוון של חומרים לא תואמים ביולוגית, כל אחד מציע יתרונות ברורים עבור תרבות chondrocyte.

  • (בקיצור:0Cross-linked dextrantureFLT:1) (למשל Cytodex): הידרופיליק ושקיפות, המאפשר תצפית מיקרוסקופית; לעתים קרובות מצופה מהתנגשות או ג'לטין לשיפור ההחזקה התא.
  • (ב) ⁇ :0 (ב"ב): 1: חזק מבחינה מכנית ושימוש נרחב; עשוי להיות מטופל על פני השטח עם ציפויי תרבות רקמות או קבוצות טעון לקדם דבקות.
  • (FLT:0)Gelatin-או התנגשות מיקרוקרטיירים מקוטבים 1FLT: לספק ממטריקס חוץ סלולרי יותר (ECM)-כמו הסביבה, אשר מסייע לשמור על chondrocyte differentiation ו ECM deposition.
  • (ב) ⁇ :0) מיקרו-קריירים מיקרו-קרילרים (למשל, CultiSpher): לאפשר לתאים להתחלחל ולגדול בשלושה ממדים, להגדיל את שטח פני השטח הזמין ואת צפיפות התא.
  • (FLT:0) מיקרו-קריירים בעלי משקל גבוה יותר (למשל, בהתבסס על חומצה פולית-אקו-גליקולית) או חומצה היאלורונית): לחסל את הצורך בצעד הפרדה לפני השתלה, כפי שניתן להשתוללף עם תאים.

הבחירה של סוג מיקרו-קרייר תלויה בדרישות ספציפיות של פרוטוקול הרחבה של צ'ונדרוציטים.ציפוי משטח, צפיפות מטען, גודל פצע, ונוקשות מכנית כל השפעה על דבקות תאים, התפשטות ויציבות פנוטיפ. מיקרוקאריירים מודרניים מונדסים כדי לחקות את ECM הטבעי של cartilage, מספק רמזים כי דכאומנטציה - בעיה נפוצה במונו-שכבת תרבות שבה nd התנגשות סוג של גולגולת ואבד את הביטויים אופייניים IIggercan.

היתרונות של התרחבות צ'נדרוציטים מבוססת מיקרוקריירי על פני תרבות 2D המסורתית

הרחבה מסורתית של צ'ונדרוציטים סובלת ממספר מגבלות קריטיות: שטח משטח מוגבל לנפח יחידה, דשונה מהירה, והצורך לעבור מחדש שמוביל להזדקנות.

  • (FLT:0) גדל באופן משמעותי על פני השטח ביחס לנפחים (FLT):1: מעבורת יחיד של השעיה מיקרו-קרייר יכולה לספק שטח שטח שטח שטח שטח שטח שווה למספר סנטימטרים רבועים של תרבות מונופל, צמצום דרמטי של טביעת הרגל של מערכת התרבות ומאפשרת התרחבות של חתימות גבוהה ביולוגיים.
  • (FLT:0) Preservation של chondrocyte phenotypeFLT:1: הסביבה תלת-ממדית (3D) המסופקת על ידי microcarriers מקדם אינטראקציות תא-תאים ותא-מטריקס הממחישים את התוספת של Native articular articular cartilage.This Space Organization מסייע לשמור על הביטוי של סוג הקולגן II, aggrecan, ו-Sox9, בעוד מדכא את השינוי לכיוון סוג של תרבות טיפוסית ID2.
  • (ב) (ב) ,0) טיפול ומעבר מספר 1: משום שניתן להגדיל את התרבויות המיקרו-קריירות בריצה ביולוגית יחידה, ניתן להרחיב את התאים למספרים הרלוונטיים מבחינה טיפולית (1003FLT:2803FLT 3–10FLT:49FLT:5) ללא מספר הצעדים המשתדלים הנדרשים במונו-שכבות, ובכך להפחית את הלחץ המצטבר והתפקוד המצטבר של האובדן.
  • (FLT:0) יעילות ובקרת תהליכים (FLT):1: השימוש בביולוגיים מעוררים או רוקינג מאפשר שליטה מדויקת של pH, מתמוסס חמצן, טמפרטורה ואספקה תזונתית.אכילה אוטומטית ניטור עלויות העבודה וגמישות, ביצוע תרגול ייצור טוב (GMP) עמידה יותר בהסתברות.
  • (FLT:0) קלקציה והורדת עיבוד הזרם של עיבוד: לאחר התרחבות, תאים יכולים להיות מנותקים ממיקרו-קריירים באמצעות טיפול נזימטי עדין (למשל, לנסותפסיה או קולגאז) או על ידי מיקרו-קריירים רגישים לטמפרטורה המשחררים תאים על קירור.

שיטות מפתח עבור גדול-Scale Chondrocyte הרחבה על Microcarriers

הרחבה מוצלחת בקנה מידה גדול מסתמכת על התזמורת הזהירה של כמה שלבים, מהיערכות מיקרו-קרירה ועד קצירת תאים.הסעיפים הבאים מכנים את השלבים הקריטיים.

המונחים: Microcarrier Conditioning and Coating

מיקרוקאריירים חייבים להיות מיובשים, סטריליים, ולעתים קרובות לפנים עם מולקולות הדבקה-מניעה לפני שהתאים רואה.פרוטוקולים משתנים על ידי חומר: חרוזים דקסטרניים דורשים נפיחות ב- PBS, בעוד מיקרוקאריירים ⁇ עשויים צריך רטוב תחת לחץ מופחת כדי להסיר אוויר מ pores.combinant colln סוג סינתטי II, fibron, או חלבון סרום משמש כדי להפחית את הדבקת (xeptic) כדי להפחית את השרירים.

תנאי מזג אוויר וביולוגי

צפיפות הראייה אופטימלית נעה בדרך כלל בין 5 × 10FearLT:0 (4Feloal Seeding צפיפות:1 ל 2 × 1003FLT:25FLT 3 תאים ל mL של נפח התרבות, עם ריכוז מיקרוקאריבי של 1-10 מ"ג / mL. הביולוגי מופעלת ב- אצווה, מזין או מצב של עירוי.

מדיום תרבות הוא בדרך כלל פורמולה ללא סרום או סרום מצורף עם גורמי צמיחה כגון TGF ⁇ 1, FGF-2, IGF-1, אשר מקדם התרחבות תוך שמירה על שונות chondrogenic. מתח חמצן יכול להיות מופחת ל-5% חמצן כדי לחקות את הסביבה ההיפקססיבית של cartilage Native, צמצום הלחץ החמצן ושימור phenotype.

פיקוח ואיכות

במהלך ההתרחבות, הפרמטרים המרכזיים חייבים להיות במעקב: צריכת גלוקוז, ייצור לקטט, pH, ודחיסות תאים מבוזרת מוערך על ידי דגימה ספירה וספירת Nuclei לאחר מכתים גבישיים viability הוא העריך באמצעות הסרה כחולה או חי / חי / דה כפיסים. עבור יישומים קליניים, בדיקות תקופתיות עבור סטריטיסמה, וסיום הוא המנדט של qggenic על ידי ק"גניקה, כמו גם על ידי סגסוגת פונקציונליתיקים פונקציונליתיקים (SoCR) על ידי ⁇ פונקציונליתיקים פונקציונליתיקים פונקציונליתיקים פונקציונלית, על ידי ⁇ , על ידי ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇

איסוף צ'ונדורוציטים ממיקרוקרייר

קציר הוא צעד קריטי שחייב איזון תשואה גבוהה עם שמירה על יכולת התא ותפקוד.

  • (FLT:0) אנזימים העיכולFLT:1: שימוש בנסופסיה או קולגאז כדי לנתק תאים משטח המיקרו-קרייר.זה יעיל אבל יש צורך בזהירות להימנע מעומס יתר שפוגע קולטנים משטח.
  • (FLT:0) שחרור מבוסס טמפרל 1: Microcarriers המצופה עם פולימר בעל טמפרטורה (למשל, פולי(N-isopylacrylamide) נפיחות או כווץ עם שינוי טמפרטורה, שחרור הסדין ללא אנזימים.
  • (FLT:0) ריגוש מכני של LT:1: צינורות גנטל או מערבול לאחר טיפול נזימטי מסייע לפירוק תאים.פלישה דרך נירוסטה או ניילון mesh (100-200 מיקרומטר) מפריד תאים ממיקרו-קרירים.
  • (FLT:0) דירוג המיקרו-קרייריפאל (Fearph:1): עבור מיקרו-קריירים בעלי ערך ביולוגית (למשל, ג'לטין או מבוסס PLGA), ניתן לאסוף תאים לאחר פירוק נושא, ולא להשאיר שום חומר זר.

אתגרים ב- Microcarrier- Based Chondrocyte

למרות הבטחתו, טכנולוגיית מיקרו-קרייה אינה ללא מכשולים שיש לטפל בהם לאימוץ קליני נרחב.

ההרחבה Cell Attachment ו- Microcarrier Aggregation

שילוב בלתי צפוי במהלך שלב ההתבוננות יכול להוביל להתפלגות תאים heterogeneous, עם כמה microcarrierים שנותרו ריקים ואחרים להרכיב אגרגציה גדולה. Aggregation יוצר דיפוזיה, גרימת necrosis בליבת וצמצום התשואות הכוללות.אסטרטגיות כדי להפחית את הסגירה כוללת דינמית (מתעוררות לסירוגין), השימוש של מפולנים נמוכים, ולהוסיף של כמה שעות נוגדות תאים ראשוניות.

אובדן אדישות ותופעות לוואי

בעוד מיקרוקארייר מעכב את הדיסדנציה בהשוואה לתרבות 2D, התרחבות ממושכת עדיין יכולה להוביל לשינוי הדרגתי לכיוון פנוטיפ דמוי פיברבסטוד.זה בעייתי במיוחד כאשר תאים מורחבים מעבר לשלוש עד ארבע מכפילות אוכלוסייה. החוקרים חוקרים חוקרים בודקים את השימוש בתרבות מיקרו-מושברית נמוכה, בקרה מיקרו-גרפיית, ותוספת של מולקולות chondroinduce (Dance-Greative) ללא אות התרחבות, או D7D.

זיהום ו Scalability

שמירה על סטריליות בביולוגיים גדולים היא מאתגרת.סגור-מערכת הביולוגיים עם מחסומים סטריליים משולבים ורכיבים לשימוש יחיד מועסקים יותר ויותר כדי להפחית את הסיכון.עם זאת, העלות של שקיות ביולוגיות חד פעמיות ומיקרו-קרירים יכול להיות משמעותי עבור ייצור GMP. Scaling ממעבדה (50–500 מ"ל) להיקף קליני (1050) דורשת תהליך זההזההזההזההזההזההתחייב להבטיח מקבילה וזרימה באיכות עקבית.

« « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « « «

סוכנויות רגולטוריות (FDA, EMA) דורשות אופי נרחב של המוצר התא, כולל הדגמה של זהות, טוהר, עוצמה ובטיחות.נוכחות של שברים מיקרו-קריטריים השוכנים בהפסקת ההשעיה התא הסופי חייב להיות ממזער ומופיע להיות לא רעיל.עבור מיקרו-קררים הניתנים ל biodegradable, המוצרים ההשפלה חייבים להיות מאופיין ומוכחים על ידי יצרנים ביולוגיים.

יישומים קליניים ומסחריים של Microcarrier-Expanded Chondrocytes

התרגום של microcarrier-expanded chondrocytes לתוך תרגול קליני צובר תאוצה.כמה חברות ומרכזים אקדמיים החלו חלוץ chondrocyte השתלה (ACI) וממטריקס-מסיסה ACI (MACI) באמצעות תאים הורחבו על microcarriers טוב יותר בגרימת כאבים מעוררים.

טיפולים chondrocyte של Allogene הם גם בפיתוח.שימוש microcarriers, זה אפשרי להרחיב את הchondrocytes של התורם יחיד לטיפול בחולים מרובים, צמצום עלויות ומאפשרת מוצרים - Shelf. מחקרים במודלים בעלי חיים (למשל, ארנב וכבש) הראו כי כל ndrocytesic התרחב על microcarcarres יכול להשתלב פגמים חיסוניים משמעותיים או חיסון יעיל.

מחקר עדכני חקר גם את השילוב של chondrocytes עם 3D-printed scaffolds. על ידי לראות תאים על פיגומה בצורת אישית, ביו-דמדן לאחר התרחבות מיקרו-קרייר, המנתחים יכולים בדיוק למלא פגמים בלתי סדירים להשיג שילוב מכני טוב יותר. A מחקר על ידי Malda et al. הוכיחו כי תאים פרוגנריים מצופה למחצה הורחבומטר על ידי מיקרופורוזיס פוטנציאלי נשמר על ידי מיקרוסקופית חומרים מבוזרים.

פרספקטיבה עתידית: הגבול הבא במיקרוקרייר טכנולוגיה לתיקון קרטלאז

התחום מתפתח במהירות לעבר מערכות מתוחכמות יותר המשלבות תרבות מיקרו-קרייה עם ניטור בזמן אמת, אוטומציה וחומרי ביו-חומר מתקדמים.

שילוב של ביולוגיים ומעבד טכנולוגיה אנליטית (PAT)

ביולוגיים עתידיים יכילו חיישנים לא פולשניים לצפיפות תאים, עוצמה וריכוזים מטבוליטים, המאפשרים שליטה בזמן אמת על האכלה וחמצן. Raman spectroscopy, בדיקות קיבול, ו coherence אופטית tomography מותאם למעקב מקוון של תרבויות מיקרו-קריירה. גישה זו מבוססת נתונים תשפר את הגמישות ותקטין את הצורך עבור התאמות לא מקוון עבור תאימות עבור ציות רגולטוריות גדולות.

ג'ין אדית ו- Microcarrier תרבות

CRISPR-Cas9 וכלים אחרים של מדיטציה גנים משמשים chondrocytes כדי לשפר את יכולת ההתחדשות שלהם.לדוגמה, גניבת גן ssenescence-ied p16INK4a או ביטוי יתר של טלמראז יכול להרחיב את יכולת ההתרחבות ללא סיכון מיקרוקרייר הם פלטפורמות אידיאליות לאספקת רכיבי הגן (למשל, לא חלקיקים), או CMsygian גדול כדי לייצר עמידות על ידי תאים.

המונחים: Microcarrier Formulations

במקום להשתמש במיקרו-קריירים של ה-Shelf, אסטרטגיות עתידיות עשויות לכלול מיקרו-קריירים ספציפיים לחולה שמקורם ב- ECM או פלזמה אוטולוגית. "Bio-inks" המכילה מיקרו-קריירים וchondrocytes מפותחים עבור bioprinting 3D, המאפשר יצירת מבנים מגובשים, מחסנים שיכולה לחקות רקמות מרובות עבור ניתוחי אינטרנט.

שילוב עם אסטרטגיות Immunomodulatory

Osteoarthritis כרוך chondrocytes pro-inflammatory שיכול לפגוע ציטונדרוציטים מושתלים. co-תרבות של microcarrier-expated chondrocytes עם Cytokines immunosuppressive (למשל, IL-10, TGF ⁇ ) או תאים T רגולטוריים (Tregs) עשויים לשפר את הישרדות graft. חלק מהם הם ציפוי microcarresic עם גורמים דלקתיים עם דלקת מפרקים כדי ליצור זיהומים.

מסקנה

טכנולוגיית Microcarrier התפתחה כאבן הפינה של הרחבה בקנה מידה גדול של chondrocytes לתיקון טרחוס, מעל המגבלות של תרבות דו-ממדית מסורתית. על ידי מתן סביבה תלת-ממדית המשמרת פנוטיפ, הגדלת היחס פני השטח-לנפח, ושילוב באופן פעיל עם אוטומציה ביולוגית, מיקרו-קריפטרנטים מאפשרים לדור של מספרים קליניים רלוונטיים של איכות גבוהה יותר, כמו שיטות טיפול אורגניות מתקדמות, כגון טיפוליות, כגון טיפול סטנדרטיות, כגון טיפול סטנדרטיות, כגון טיפול אורגניות, כגון טיפול סטנדרטיות, טיפול סטנדרטיות, טיפול סטנדרטיות, כגון טיפול סטנדרטיות, טיפול סטנדרטיות, טיפול סטנדרטיות, כגון טיפול סטנדרטיות, טיפול סטנדרטיות, טיפול תרופתיות, טיפול תרופתיות, טיפול סטנדרטיות, טיפוליות, טיפוליות, טיפוליות, טיפול סטנדרטיות, טיפול סטנדרטיות, טיפוליות, טיפול סטנדרטיות, טיפול תרופתיות, טיפוליות, יעיל, כגון טיפול תרופתיות, טיפוליות, יעיל, טיפול תרופתיות, טיפול תרופתיות, כגון שיטות טיפול תרופתיות, טיפול סטנדרטיות, טיפול תרופתיות, כגון טיפול תרופתיות, טיפול תרופתיות, טיפול תרופתיות, טיפול סטנדרטיות, טיפול סטנדרטיות, טיפול תרופתיות, טיפול סטנדרטיות, טיפול תרופתיות, טיפול

אזכורים חיצוניים לקריאה נוספת:

  • [ה] מלדה, ג'., ו'[28]: "הטבע מקבץ את הchondrocytes על מיקרו-קריירים לתיקון קלחוס" (FLT:0)
  • וריקל (MACI: Autologous Cultured Chondrocytes on a Porcine Collagen Membrane)
  • דינג, א', ואל-. (2020) "הסקרקריקרים בהנדסת רקמות טרחוס: התקדמות ואתגרים" (FLT:0BiomaterialsFLT:1;2 https:2 ;2 ;2 ;09/01/10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.10