Table of Contents
הקדמה ל Chromatography ו Ionizable Compounds
Chromatography נשאר אחד הטכניקות האנליטיות החזקות ביותר עבור הפרדה, זיהוי, ורכיבים קוונטיים בתערובת מורכבת. inנוזל chromatography, הקומפוזיציה שלב הנייד ישירות שולט בהתנהגות השימור של אנאליטים. כאשר אלה אנאליים הם ionable - משתנים, בסיסים, zwitterions, או amphoteric - ה- pH של שלב נייד הופך פרמטר קריטי על ידי שליטה באסטרטגיות של סטיות בסיסיות, סטיות, סטיות, יכול לשפר את תופעות לוואי לאחור, סטיות, סטיות, רזולוציה לאחור, סטיות, סטיות, סטיות, רזולוציה לאחור, רזולוציה לאחור, רזולוציה לאחור, סימולציה, סימולציה, סימולציה, סימולציה, סימולציה משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, סטיות, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, משככי כאבים, סטיות, משככי כאבים, משככי כאבים,
חסרונות בלתי ניתנים להשגה ו- pH-Dependent Behaviour
חומצות, בסיסים, ו Ampholytes
תרכובות אפשריות מכילות קבוצות פונקציונליות שיכולות לתרום או לקבל פרוטונים. חומצות Carboxylic (R-COOH), פנול, וחומצות sulfonic הן קבוצות חומציות טיפוסיות. Amines (R-NHFLT:02reas שלב pH: 8FLT:1), חומציות חסודות וגורנים הם קבוצות בסיסיות.
⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
ה- pKearFLT:0 â € 1 של קבוצה ionizable הוא ה- pH שבו מחצית מהמולקולות נמצאים בצורת המינון וחצי הם נייטרליים. משוואה הנדרסון-האסלברכ מתארת איזון זה:
(ב) ויקרא י"א): "וַיָּבְהִיאֶתְהִיאֶת הוּא הוּא הוּא הוּא הוּא" (ב)
(ב) ויקרא י"א): "ב' (ב) ויקרא י"ד:2 ויקרא י"ד)
כאשר ה- pH שלב הנייד הוא שתי יחידות מתחת ל- pKFLT:0igaFLT:0cioaFLT:1 של חומצה, יותר מ-99% מהמולקולות הן בצורת נייטרלית (HA) לעומת זאת, שתי יחידות מעל pKreaFLT:2aph3 של pH: תוצאות ב- 99% ionized (A-A) עבור בסיסים, הפוך זה חל על פני בינארי בין המדינות שלא ננקטו על ידי שינוי דרמטי.
כיצד pH משפיע על הכוונות ב-Phase Chromatography
גזע נייטרלי לעומת Ionized Species
בהיפוך-phase chromatography, השלב הנייח הוא הידרופובי (בדרך כלל C18). Neutral, non-polar אנאליtes חלוקה חזק לתוך השלב הנייח, וכתוצאה מכך זמני שימור ארוכים יותר.מינים Ionized הם יותר קוטבי הידרופילי; הם מעדיפים את השלב הנייד ו- pH מוחלט מוקדם יותר.
המונחים: manipulation
על ידי התאמת pH, אנליסטים יכולים לשפר באופן סלקטיבי או לדכא ionization של אריות ספציפיות בתוך תערובת.חשב מדגם המכיל חומצה (pKirFLT:0acioFLT:1 4.8) ובסיס (pKigtureFLT:2aFLT 3: 8.2) ב- pH 3, חומציות היא נייטרלית (rened) ואת הבסיס הוא חזק במיוחד עבור תרכובת ניקוי גמישה, במיוחד, כולל 7, טיפול יעיל יותר, הוא יעיל של טיפול תרופתי).
פסגות צורה וטאילינג
תרכובות איוניזנטיות לעתים קרובות לייצר צורות שיא גרוע כאשר ה- pH שלב הנייד אינו מותאם. pim אנאליס מהונדס חלקית קיימים בשני צורות כי לא לאט על סולם הזמן chromatographic, המוביל לשיאים רחבים זנב.הפעלה ב- pH לפחות אחת עד שתיים הרחק מן ה- pKFLT:0aFLT:1 מבטיח כי >% של הסימטריה אנאליתולציה היא סיבה משמעותית ל-Balicicicication המקומי.
בחירת Buffer ו- pH יציבות
Buffers for LC
בחירת buffer עם יכולת נאותה בטווח ה- pH הרצוי הוא חיוני. phosphate buffers בשימוש נרחב pH 2-3 ו 6-8, אבל הם לא תנודתיים ועשויים להיות לאתואמים עם ספקטרום המוני של ספקטרום (pH 3–4) ו acetate (pH 4–5) buffers הם תנודתיים וידידותיים ו- Ammonium (ניתן להשתמש ב-HpH2) עבור עמודהחומצה קיצונית (H) אבל הוא 1-HpHp) עבור 2-H2-H2-H) יעיל (HpH) עבור 2-HpH2-H2-HpH2-D) עבור עמודהחלודה (H2-H) עבור 2-D) אבל הוא 2-H) עבור 2-D) יעיל (H) עבור 2-H2 (H) עבור 2-H2-H2-H) עבור 2-H2 (H2 (H2-D2-HpH2-D2-D2-H2-D) אבל הוא יעיל (H) אבל הוא C.
שיפור יעילות
ריכוז הbuffer צריך להיות לפחות 10-50 מ"מ לספק כוח אקולוגי עקבי ובקרת pH.גם עם buffer, תנודות טמפרטורה יכול לשנות pH (בדרך כלל -0.01 עד -0.03 יחידות pH per °C) להשתמש תנור עמודה כדי לשמור על הטמפרטורה בתוך ±0.5 מעלות צלזיוס. בנוסף, degas שלבים כדי למנוע ספיגה דו-חמצני, אשר מורידים את ה- pH לאורך זמן.
שלב נייד pH לעומת pH Aqueous pH
כאשר מדגמים אורגניים (למשל, acetonitrile, methanol) מוסיפים, pH יעיל בתערובת הידרו-אורגנית יכול להיות שונה מ- pH החילוף האקוריד.ה- pH של השלב הנייד צריך להיות נמדד לאחר ערבוב, או לפחות pH buffer צריך להיות מותאם לחשבון עבור אפקט פתרון.
שיטות פיתוח אסטרטגיות
pH Gradients
הגישה המשותפת לפיתוח שיטת היא להפעיל ⁇ pH: מזרקת הדגימה מספר פעמים עם שלבים ניידים ב- pH 2.5, 4.0, 6.0, 8.0, ו 9.5. על ידי התבוננות בשינויים וצורות שיא, ניתן לזהות את ה- pH האופטימלי במהירות.
⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
אם ערכי ה- PKearFLT:0 (ה- 10) אינם ידועים, חיזוי חישובי זמין באמצעות תוכנה כגון ACD/Labs או MarvinSketch.הכלים האלה מעריכים את pKirFLT:2aFLT 3LT עם דיוק סביר (0.5 יחידות) לפיתוח שיטה, החל מ- pH שהוא 2 יחידות מתחת ל- pKLT3aductiona5 עבור בטוח (מעל 2 יחידות) או קודם לכן).
מחקר מקרה: חלוקת חומצות ובסיסים
נחשב תערובת המכילה חומצה חלשה (pKirFLT:0acioFLT) ובסיס חלש (pKearFLT:2aveFLT 36.5) ב- pH 3.0, החומצה היא נייטרלית ושמרה; הבסיס הוא לחלוטין פרוקטציה ו- elutes מוקדם. at pH, שניהם הם חלקיקים חלקית ועלולים coute-al at 8.0, או זמין באופן מלא, או דרישות חומצה בסיסית (reidial) הוא נמוך יותר, או בתנאי ה-H).
מעבר ל-Phase: HILIC ו- Ion-Exchange
הידרופיליק אינטראקציה נוזלי Chromatography (HILIC)
ב HILIC, השלב הנייח הוא הקוטב (למשל, סיליקה, amide, zwitterionic) וההחזקה מונעת על ידי חלוקה לתוך שכבת מים עשירה (Ionizable תרכובות להפגין התנהגות של שימור מול מול מול מול הפוך - pH: מינים טעונים נשמרים יותר HILKIC כי הם יותר הידרופיליים ואינטראקציה חזקה עם שלב קוטבי, נמוך, pH חיובי, יש צורך) בכבדות (HILK) הוא חייב להיות טעון בכבדות (pic) בכבדות גבוהה, כלומר, הן תכונות טיפול פסיכולוגיות (חומצה כבדה).
Ion-Exchange Chromatography
ב-ion-exchange chromatography, pH שולט על המטען הן בשלב הנייח והן על פי ה- אנאליט.עבור החלפת שבץ חזקה (SCX), השלב הנייח הוא חומצה סולטונית אשר תמיד טעון באופן שלילי; עלייה בשמירתה של משככי אישום חיובי.0 ל- pH כדי להעצים את ההחזקה הבסיסית באופן מלא (WAX), התחנה הרירית מכילה בסיס חיובי: 0F)
טמפרטורה, כוח איטוני ואפקטי Solvent
טמפרטורה תלות
הטמפרטורה לא רק משנה את הסטיות והדיפוזיה אלא גם משמרות páveFLT:0.02 ערכים (בדרך כלל -0.02 -0.04 pKirFLT:2aFLT 3 יחידות ל- pH עבור רוב החומצות והבסיסים).
כוח איטוני
ריכוז מלחי החיץ (כוח יון) משפיע על הפעילות של מינים טעונים, ובכך מעט לשנות את יעילות pKirFLT:0aph:1 כוח ionic גבוה יותר יכול למסך אינטראקציות אלקטרוסטטי עם silanols שאריות על השלב הנייח, צמצום הזנב עבור תרכובות בסיסיות.
השפעה אורגנית
(א) איסטוןטרייל ומנומול יכולים לשנות את ה- pKirFLT לכאורה:0 (aFrea15) של שיווי משקל אנאליים על ידי שינוי התכונות הקבועות וההתמדה באופן כללי, הוספת פתרון אורגני מפחית את השינוי pKKKKáve:2aFLT 3:2aFLT 3 של חומצות ומגדיל את ה- pKFLT:5 של בסיסים, המגביל את מדד ה- pH הניטרידלהלן, במיוחד, אשר נותרת ה- pH.
נושאים מתקדמים: Co-Ion Effects andמעורבות-Mode Phases
השפעות קו-און ונגד-Ion
ב ion-pair chromatography, תוספת של נגד (למשל, TFA, heptafluorobutyric חומצה, או triethylamine) יכול ליצור זוגות ion עם אנאליטים מואשם, ביעילות מסיכה אופטימיזציה ולהגדיל את השימור. pH עדיין שולט במצב הטעון של ה-pagent ו- ion-Regent לדוגמה, ב- pH הוא עדיין refated-TFA-T.
שלב התחנה המעורבת-Mode Stations
עמודות מעורבות-Mode משלבות את ה-conphase עם פונקציונליות ion-exchange (למשל, C18 + חילופי ion חלשים) שלבים אלה מציעים אוthogonal וניתן לכוונון על ידי pH.ב pH נמוך, קבוצות חילופי הבצל מכוונות ושומרות על כאבים שליליים; ב- pH גבוה, הם ניטרליים ורק לאחור-phase מנוחה מתרחשת טור כזה נפוץ יותר ויותר.
מלכודות ובעיות
תשומת לב בלתי צפויה
אם זמני שימור נסחף בין ריצות, חשדו חוסר יציבות ב- pH.בדוק כי החיץ טרי, ה- pH אלקטרודה הוא calibrated, ואת השלב הנייד מוכן כראוי.בנוסף לוודא שהעמודה היא שווה לחלוטין (10 עד 20 כרכים) לאחר שינוי אינטראקציות pH. Silanol עם תרכובות בסיסיות יכול לגרום לשינויים הדרגתיים כמו גיל העמודה; לשקול שימוש בעמודה נמוכה או גבוהה כדי למנוע עצירות.
פסגות או כתפיים
אם שיא מופיע פיצול או יש כתף, ה- pH של שלב נייד קרוב ל- pKreaFLT:0acioFLT:1 של ה- אנאליט, מה שגורם להפרעה איטית בין שני צורות. לנגיף pH לפחות 1.5 יחידות מ- pKreaFLT:2aFLT 3: לחלופין, להגדיל את הטמפרטורה כדי להאיץ את הקינטיקה, אבל שינוי הוא בדרך כלל יעיל יותר.
המונחים:
דחפורים פוספטים יכולים להטיס עם מפלט אורגני בריכוזים גבוהים.תמיד לערבב buffer ואורגני ביחס הסופי לפני השימוש, ולהימנע מריכוזי מלח גבוהים מדי ( ⁇ 100 mM) באמצעות מבולבלים תנודתיים (איור, acetate) מקטין את הסיכון הזה.
מסקנה
(ה- pH של שלב נייד הוא משתנה מאסטר ב chromatography של תרכובות מודרניות ionizable.It קובע את מצב המטען של משככי כאבים, אשר בתורו שולט שימור, סלקטיבית, ואת איכות שיא בפתול לאחור, HILIC, ו-ion-exchange מצבי סימולציה משולבים; מאסטרי של pH אפקטים דורש הבנה מוצקה של pKFLT:0apherpherpher, כלומר, רזולוציה יעילה ביותר, באמצעות שיטות בקרה ואפקטים, כולל, כולל, כולל של רזולוציה של סימולציה של רזולוציה ואפקטים, כולל, כולל, כולל, ואפקטים, על ידי סימולציה של סימולציה של סימולציה של סימולציה של סימולציה של סימולציה: