מבוא ל- pH Buffering in Cell Culture

יציבות תאים היא הבסיס של מחקר ביולוגי אמין ויישומים ביוטכנולוגיית.בין המשתנים הרבים המשפיעים על בריאות התרבות, pH מדורגת כאחד הקריטיים ביותר.ריכוז המימן משפיע ישירות על אנזים, תחבורה קרום, ביטוי גנים, וטרטרטרקטינים מטבוליים אלה של בסיסים קלים של 0.2 יחידות pH עבודה בטווח האופטימלי יכול לעורר תגובות, להפחית את הרגישות, שינוי המוצר, ופתרון יעיל, הסתברותי בדרך כלל, כדי לשמור על תפקוד תאים בינוניים.

מדוע פיזיולוגיה חשובה עבור פיזיולוגיה סלולרית

תאים רגישים להפליא pH סלולרי.Intracell pH מוסדר היטב על ידי מעבורות ומשאבים, אבל הסביבה החיצונית משפיעה על ⁇ s כי מניעים עלייה תזונתית ופסולת הסרת פסולת. תהליכים סלולריים רבים יש pH: לדוגמה, פעילות של טיפות pH-רפואיות מספיק כדי להשיג סביבה חומצית גבוהה, בעוד אנזימים cytoplasmic לתפקד טוב ביותר בתוך נייטרליות תאים, למשל, הם תוצאה של טיפולית נמוכה של פחמן דו-חמצני.

שם הסרטון: The Buffer Mechanism: A Quick Review

חיץ מורכב חומצה חלשה ובסיס ההדבקה שלה (או בסיס חלש וחומצה conjugate שלה) בתקשורת תרבות התא, מערכות החיץ הנפוצות ביותר מבוססות על דו-קרבאט (HCO3- / CO2) ותרכובת ה- zwitterionic HES HEPES.מערכות אלה מצייתות למשוואה הנדרסון-הסלבלכ:

(ב) ויקרא י"א: ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇

כאשר מוסיפים חומצה, הבסיס הדווע צורך את ה- H+ ions, שינוי שיווי המשקל כדי לשמור על pH. .conversely, כאשר בסיס נוסף, החומצה החלשה תורמת פרוטונים.TheFLT:0bufferingקיבולת קיבולת קיבולת קיבולת PHFLT:1 תלוי ריכוז הכולל של זוג החיץ ואת הקרבה של הפתרון ל- pKa בדרך כלל צריך להיות תאים אופטימליים של bua 7K2.

סוכני מזון משותפים ב- Cell Culture Media

כמה סוכני כיפוף משמשים באופן שגרתי, כל אחד עם יתרונות ומגבלות נפרדים.הבחירה תלויה בסוג התא, מערכת התרבות (פתוחה מול סגורה, סטטית לעומת דינמי), דרישות ניסיוניות או הייצור ספציפיות. להלן הן המערכות המאומץות ביותר.

Sodium Bicarbonate (NaHCO3)-CO2 System

Sodium bicarbonate הוא buffer פיזיולוגי המשמש ברוב אמצעי התרבות התא סטנדרטי (למשל, DMEM, RPMI-1640) הוא מתפקד כמערכת פחמן דו-קרבונט פחמן דו-קרבנית: כאשר מומס במים, הוא יכול להיות חומצי פחמן, אשר מתפזר לתוך bicarbonate ו- H +. CO2 באטמוספירה in the in the in the in the in the קיבולת 5- 10-xic) הוא במהירות משתנה עם רמות חום-p-p-relicul-reli-reli-p-reli-co-co-reli-reli-p.

תגית: buffer

HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה) הוא buffer zwitterionic עם pKa של בערך 7.5 ב 37 °C. זה שומר ביעילות pH ללא תלות על CO2, מה שהופך אותו אידיאלי עבור יישומים שבהם בקרת C2 מטבול מוגבלת או עבור ניסויים שבוצעו מחוץ ל- Cubator, כגון התבוננות קיצונית ב- 20 סוגים של ריכוז הוא לעתים קרובות.

שילוב מערכות ו- Buffers אלטרנטיביים

פורמולות מדיה מודרניות רבות מכילות גם HEPES ו-Sodium bicarbonate כדי לנצל את החוזק של שניהם: דוקרבונט שומרת על בסיס פיזיולוגי בעוד HEPES מספק יכולת מטבולית נוספת נגד חומצות מטבוליות.עבור יישומים מיוחדים, אחרים buffers סינתטיים יכולים לשמש לעתים קרובות.MoPS (3-N-morlino) חומצה פולינזירית (N-N) לשימוש ב-N-N-morton) חומצה פולינזילהי)

השפעת pH Buffering על יכולת התרבות של תאים

מערכת מבול מעוצבת היטב משפרת באופן ישיר את יציבות התרבות על ידי צמצום תנודות pH.יציבות זו מתרגם לכמה הטבות למדידה.

שיפור יעילות התאים והצמיחה

כאשר pH נשאר בטווח האופטימלי (כ-7.2–7.4), תאים חווים פחות מתח.לדוגמה, תאי ה-bary (CHO) הסינים, בשימוש נרחב לייצור נוגדנים מונוקלוני, לשמור על יכולת מעל 90% מעל תרבויות מרובות ימים כאשר pH נשלט, בהשוואה להפחתה מהירה כאשר pH נסחף מתחת ל-6.8 או מעל 7.6.

שיפור פעילות המטאבולית ומוצריות

שיעורי חילוף החומרים הם pH תלוי.צריכה גלוקוז, ייצור לקטט, ומטבוליזם גלוטמין כל שינוי pH שינויים.ב bioreactors, ירידה pH לעתים קרובות מתואמים עם הדור הנקה מוגברת, אשר עוד חומציות המדיום במחזור אכזרי. pH יעיל מתחזק שמירה על האיזון של ניצול תזונתי ופסולת, המוביל לתנודות תאים גבוהות יותר ולהגדיל חלבון נכנעים תאים הוכחו על ידי פיתוי תאים ויראליים.

שיפור רב יותר בניסוי

הבדלים בין כלי תרבות, בין חומרים פנימיים, או מיום ליום יכולים להציג את הרגישות המסיימת אותות ביולוגיים אמיתיים.מערכת חיץ חזקה מצמצם את ההבדלים הללו, ומבטיחה כי אותם תנאים ניסיוניים מניבים תוצאות עקביות.זה קריטי במיוחד בהקרנה גבוהה דרך גבוהה, שבו נדרשת קבינט ללוחציה.

דרושים שינויים בינוניים והתאמות

בתרבויות סטטיות, סחף pH דורש לעתים קרובות תחליף בינוני, הגדלת העבודה, עלויות reagent, ואת הסיכון של זיהום. Buffers עם יכולת גבוהה (למשל, HEPES הוסיף ב 25 mM) יכול להאריך את הזמן בין האכלה בתרבויות צפופות. עבור תהליכים תעשייתיים, זה מתורגם לתוך היתוך ארוך יותר עלויות הפעלה נמוכות יותר.

שיקולים מעשיים לבחירת משתמשים וניצול Buffers

שום מערכת חד-פעמית לא מתאימה לכל יישום.הגורמים הבאים צריכים להנחות את הבחירה:

  • (FLT:0Cell typeveFLT:1): תאים ראשוניים ותאי גזע דורשים לעתים קרובות אמצעי תקשורת עם שליטה pH מדויקת וחשיפה מינימלית ל- Buffers סינתטיים. HEPES יכול לשמש, אבל בריכוזים נמוכים יותר.
  • (FLT:0Culture FormatFLT:1): מערכות פתוחות (למשל, משיכת ים, לוחות רבוול) לאבד את CO2 במהירות; כאן, מערכת דו-קרבנית בלבד תהפוך אלקלליין אלא אם כן ה- incubator יש רמות CO2 גבוהות. HES מומלץ מאוד עבור פורמטים פתוחים.
  • (FLT:0) גידול וצפיפות תאים 1FLT: תרבויות בעלות גבוהה לייצר יותר חומצה.יותר buffer (למשל, 25 mM HEPES) עשוי להיות נחוץ, אבל לחץ אוסמוטי צריך להיות נשמר מתחת -320 mOsm / ק"ג כדי להימנע רעילות.
  • (FLT:0) תנאים כירורגיים 1: בניסויים הדורשים תקופות ארוכות מחוץ ל- incubator (למשל הדמיה של תאי חיים, כפי שמעידים רגישים ל- pH), השתמשו ב- HEPES ב-20-25 מ"מ למניפולציה לטווח קצר, ריכוזים נמוכים יותר.
  • (FLT:0) תאימות עם יישומים במורד הזרם 1FLT: חלק מהמבולרים יכולים להפריע להערות ביוכימיות מסוימות.לדוגמה, HEPES יכול ליצור תוספות בספקטרום המוני אם בשילוב עם דיל מתיל sulfoxide.בדוק כי ה-buffer אינו מסיכה או שינוי אותות אנליטיים.

בעת הכנת מדיה, תמיד סינון-סטריליזציה לאחר הוספת buffers והתאמה pH לערך היעד (בדרך כלל 7.4) באמצעות NOH או HCl. עבור מדיה המכילה פחמן- המכילה, ה- pH חייב להיות מוגדר תוך bubbling עם CO2 או לאחר השוויון ב- CO2 incububator, כי pH של הפתרון הסופי הוא תלוי pH על CO2 מתח.

עקבו אחרי pH in Cell Culture

אפילו מערכת השחיקה הטובה ביותר לא יכולה להבטיח יציבות ללא ניטור.האינדיקטור ה- pH הנפוץ ביותר בתקשורת הוא פנול אדום (אינדיקטור pH Colorimetric pH כי מעברים צהוב ב- pHFLT:0 8.2) בעוד נוח, phenol אדום יכול להפריע כמה אסימונים ואת שינוי צבעו הוא סובייקטיבי. עבור מדידה מדויקת, להשתמש ב- pH ממותק עם בדיקה המיועדת עבור חיישנים קטנים עבור ניטור יעיל, אך ורקמותרפיסט (מ"מ"מ"מ"מ) הם הכרחיים סטנדרטיים, אך הם הכרחיים, אך ורק מדדים סטנדרטיים, אך ורקמותרפיים, טיפול ידניים, טיפול ידניים, אך הם הכרחיים, טיפול ידניים, אך ורק ב-ממד סטנדרטיים, טיפול יעיל.

פתרון pH Drift

(הופנה מהדף ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇

אסטרטגיות מתקדמות וכיוונים עתידיים

(הביקוש לתרבות התא ביומניפולינג, טיפול בתאים, ומחקר באיברדיואיד מניע חדשנות בטכנולוגיית ה- pH 6) חוקרים חוקרים את השימוש ב-FLT:0 תחת שליטה על שבבים שפותחו על ידי קיבולת של 1+Fua) אשר משחררים סוכנים מטבוליים בהדרגה כמו pH / FLT:2 אנרגיה מעצימה (Rateating) עם מטבוליזם של מטבוליזם גבוה יותר, אך גם כן, אך ורקמות (FVerto-Fulating) ממין) מצמצם את רמת ה-Frugating) היא גם כן, אך עדיין יעילה יותר, אך היא יעילה יותר, אך היא גם כן, אם היא גם כן, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא גם כן, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, כאשר היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, כאשר היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא עדיין, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא יעילה יותר, אם היא גם כן, אם היא עדיין, אם היא יעילה יותר,

מסקנה

מערכות ה- pH אינן אמצעי חיוני לשמירה על הסביבה הכימית שהתאים צריכים לשגשג.על ידי הבנת עקרונות הכימיה של הכימיה, הערכת הבורסות בין סוכנים משותפים כגון דוקרבונט ו- HEPES, ומימוש בחירה זהירה על בסיס פורמט תרבות וסוג תאים, החוקרים יכולים לשפר מאוד את יציבות התאים הבריאים, אינטגרטיביים יותר, ומוצרים ביולוגיים-מתאים יעילים יותר: