הקדמה: Epigenetics כמו מאסטר רגלטור בתרבות התא

תרבות ה- Cells הייתה אבן הפינה של מחקר ביו-רפואי במשך יותר ממאה שנים, המאפשר למדענים ללמוד תהליכים סלולריים בסביבה מבוקרת, פשוטה, אך במשך עשרות שנים, ההנחה הבלתי נמנעת הייתה שהתאים שהונחו במנה יתנהגו במידה רבה כפי שהם עושים בגוף, כל עוד חומרים מזינים וחמצן לא היו מספיקים.

מאמר זה חוקר את התהליכים האפיגנטיים העיקריים במשחקים בתאים תרבותיים, כיצד תנאי תרבות ספציפיים מעצבים את האפיגנומה, ואת ההשלכות המעשיות של חוקרים ותעשיות הנתמכות על תרבות התא.זה גם מדבר על כלים מתקדמים ללמידה ומניפולציה של מצבים אפיגנטיים, כמו גם את האתגרים הנובעים מסחף אפיגנטי וגמישות.

מכניזם אפיגנטי ⁇ לתרבות

כדי להעריך כיצד סביבות תרבות משפיעות על התנהגות התא, יש להבין תחילה את ערכת הכלים המולקולרית של אפיגנטיות.שלוש השכבות העיקריות הן מתילציה DNA, שינויים בטון, ותקנות RNA לא מרתיעות.כל אחד יכול להשתנות על ידי תנאי תרבות, ולהיפך, לשנות תוכניות ביטוי גנים.

DNA Methylation

methylation DNA בדרך כלל כרוך תוספת של קבוצה מתיל לפחמן החמישי של בסיסים צייטוסין ב CpG dinucleotides, קטזז על ידי דנ"א מתיעבראזס (DNMTs) היפרלרציה קשורה עם מעברי גנן, בעוד hypomethylation לעתים קרובות מתואם עם תעתיק פעיל.

הטון משתנה

הטונים, החלבונים שסביבם דנ"א עוטפים, יכולים להיות שונים מבחינה כימית בזנבים ה- N-terminal.com שינויים נוקשים כוללים acetylation, methylation, זרחן, ו- ubiquitination. Histone acetylation, המתווך על ידי acetyltransferases (HATs) ו deacetyes (AC), בדרך כלל, ceine ceorton ⁇ ⁇ , 227 .

RNAs לא קידוד

RNAs קטן לא קידוד, במיוחד מיקרו-RNAs (miRNAs), לווסת ביטוי גנים לאחר transcriptionally. Long non-coding RNAs (lncRNAs) יכול לגייס קומפלקסים chromatin-modifying ל loci מסוים genomic.הביטוי של מאקרו רבים הוא עצמו נשלט אפיגנטלי באופן אפיגנטי, יצירת משובים.

איך הסביבה של התרבות מעצבת את המגמגנום

הסביבה המלאכותית של כלי תרבות שונה באופן דרסטי מהנשישה של הרקמות הילידים.כל פרמטר – מהמשטח הפלסטי ועד לשלב הגז – יכול להשאיר עקבות אפיגנטיים.

זמינות תזונתית וספורט

(התקשורת הסטנדרטית מכילה לעיתים קרובות רמות עליונות של גלוקוז, גלוטמין, וסרום גלוקוז גבוה יכול לגרום לשינויים אפיגנטיים הקשורים זיכרון מטבולי; לדוגמה, תאים ימיים חשופים לתנאי תרבות היפרגליצריים להראות מתמשך H3K9 acetylation במקדם תרבות אפיגנטית מסוימת, גם לאחר שיקום גלוקוז רגיל.

חמצן Tension ו Hypoxia

רוב החומרים התקניים לשמור על -20% חמצן, הרבה מעל 1-5% אופייני של רוב הרקמות. הסביבה היפר-חמצן הזו עלולה לגרום ללחץ חמצון ונזקי DNA, מה שגורם לשכפול אפיגנטי.נהפוך, באופן verse, hypoxia מבוקר (למשל, 1–5% O2) מפעיל גורמים רגישים יותר (HFs), אשר מגייסים את הטון שלו כמו אנזימים KGicic יותר תחת לחץ דם C.

מטבחים מכניים ו- Substrate Stiffness

תאים חשים את המאפיינים המכניים של סביבתם באמצעות אינסטלינס, קידודים מרכזיים, ואת צייטופליטון זה מניקה זוגות ישירות לאמגנום. לדוגמה, כאשר MSCs לתקן את תאי ה- CPTS השונים (למשל, תרבות מכנית של טרשת עורקים), אשר הם מפעילים את תאי ה-HAP/TACRicial של תאים גמישים (למשל, גם על ידי genicial cgenics) של תאים (למשל, genicericercrecerecerence) (למשל, כלומר, generic Regenreig.

פאסינג ו-Serial Subculture

המעבר חוזר ידוע לגרום לשינויים ב-FLT:0 [pLT]:0 [bepigeneticסחף] סחף:1 – הצטברות מתקדמת של מתילציה וסימן הטון שיכולה בסופו של דבר לשנות זהות תאים.לדוגמה, hepatocytes ראשוניים מאבדים ביטוי גנטי ספציפי בכבד על פני מעברים עקב מתילגן דנ"א קבוע באלבטן ו-cytochrome P450rs מקדם.

אפשרויות להתנהגות תאים

השינויים האפיגנטיים המושרה על ידי הסביבה התרבותית מתבטאים באופן ישיר כהתנהגות תאים משתנה, המשפיעה כמעט כל היבט של תפקוד התא שנלמד במנה.

התרחבות והזדקנות

(ההתמדה אפיגנטית של ה-FLT:0)DKN2IRFLT:1 locus (encoding p16INK4a) יכול לעקוף את הסינות התאית, סימן ההיכר של קווי תאים אלמוות רבים.conversely, תרבות הלחץ יכול לגרום נזק DNA ולהפעיל תוכניות אפיגנטיות שמובילות להזדקנות מוקדמת.

המונחים: Lineage Commitment

(הבדלת תאים היא למעשה תהליך אפיגנטי: תאים חייבים להשתיק את השפע ולהפעיל תוכניות תפירה ספציפיות של קואג'ר (Primaryalization) של הסביבה התרבות יכולים להטיא תהליך זה.לדוגמה, גודל גוף עוברי ומורולוגיה משפיעים על אותות Wnting, אשר בתורו מאמת את methylation ה-PPD שלו בתרבות ה-FLT:0OCT4FLT:1 ו-LTF:2GIGID.

יכולת מטבוליזם ותפקוד

חוסר יציבות אפיגנטית יכול לגרום לתאי תרבות לאבד פונקציות מיוחדות לאורך זמן. hepatocytes ראשוני, למשל, להראות ירידה מתקדמת בפרשת אלביין ופעילות אנזים מטבוליזציה לאחר השתילה, מלווה בסימנים מדכאים ודימום דנ"א ב מעכבים ספציפיים של כבד (כמו גם, chondrocytes deiate לתוך תאים דמויי פיברבסט כאשר התרבות מפלסטיק, עם אובדן של 5azin) של תאים כימיים מסוג 2D2D.

מושג מפתח הוא (FLT:0) זיכרון גרפיטי זיכרון FIRLT:1; גם לאחר תרבות לטווח קצר, תאים לשמור כמה סימנים המשפיעים על התנהגותם העתידית.לדוגמה, גיל התורם ומצב המחלה מקודדים באפיליום ויכולים להימשך ex vivo, המשפיעים על תגובות סמים.זה יש השלכות משמעותיות על תרופות מותאמות אישית ושימוש בתאים בעלי יכולת גבוהה בסינון.

מחקר אפיגנטיות בתרבות: שיטות מודרניות

לנתח ולתפעל את המצב האפיגנטי של תאים תרבותיים, החוקרים יש ארסנל רב עוצמה של טכניקות.כל אחד מציע פתרון שונה - ממדידות אוכלוסייה גדולות להשקפות תא יחיד - והיכולת לשנות את היכולת לזהות יחסים סיבתיים.

ניתוח DNA Methylation Analysis

תקן הזהב עבור טיפול מתילציה מקיפה הוא שלם-genome bisulfite ריצוף (WGBS), המספק פתרון חד פעמית.עבור ניתוח ממוקד, הייצוג מופחת bisulfite Sequencing (RRBS) או פלטפורמות מבוססות מערך (למשל, Ilumina 850K Methylation BeChip) הם יותר מעקבים כלכליים ללא הפסקה (Ricials) כדי להחליף את אזורי ה-DMS (למשל, לעומת שינויים ספציפיים).

ניתוח Chromatin Analysis

Chromatin immunoprecipitation ואחריו סירקינג (ChIP-seq) מפות גנום מחייבות את השינויים הארוכים או גורמי היעתקה, אבל ChIP-seq דורש מספר תאים גדולים (מיליוני) ו נוגדנים באיכות גבוהה נוגדנים עבור מספרי תאים נמוכים, שיטות חלופיות כגון CUT & RUN (מחל תחת מטרות ושחרור באמצעות nuclease) ו- Cagation (תעדויות פתוחות) ו- at astrase (תות) ו-atreation Activeercreation Activeercreation) ו-in Active Index for asis Active Index for aration) ו-in Openercrecrecrecerecerecrecrectionercrecreation for aration) כדי לקדם את אמצעי רגישות נמוכה יותר.

הפרעות אפיגנטיות

מעבר להתבוננות, החוקרים יכולים לתמרן באופן פעיל את האפיגנומה באמצעות כלים מבוססי CRISPR. dCas9 fused ל-DNMT3A (DNA methyltransferase) יכול למתילאטים ספציפיים CpG, להחדיר גנים.conversely, dCas9-TET1 יכול גם לגרום לאבחון מטרות באופן דומה, dCas- 9300 יכול להפקיד H3K27acre, כדי לשפר את ה-reperes, לפעול באופן מדויק כדי לגרום לשינוי יעיל של תפקוד זה גורם.

Single-Cell Epigenomics

שיטות בולק אותות ממוצעים על פני אלפי תאים, מסיכות heterogeneity. Single-cell אפילמיקה טכניקות - כגון scBS-seq (single-cell bisulfite Sequencing), ספקטרום CUT & Tag, ו- scATAC-seq - יכול לחשוף כיצד תאים בודדים בתוך תרבות שונה באופן אפילנטי.

יישומים במחקר ובתעשייה

תובנות אפיגנטיות כבר משנות את האופן שבו תרבות התא משמשת בתחומים רבים.

רפואה חדשנית

עבור טיפולים חלופיים תאים - כגון chondrocyte השתלת לתיקון קלחוס או טינימנט פיגיום פיגמנטאלי (RPE) השתלה עבור ניוון מקולרי - חיוני כי התאים מושתלים לשמור על phenotype הנכון שלהם. סחף אפיגנטי במהלך הרחבה בקנה מידה גדול יכול להוביל לכישלון.

מחלות דוגמנות ובדיקת סמים

תאי גזע בעלי השפעה גבוהה של המטופל (iPSCs) יכולים לחקות מחלות כגון סרטן, ניוון עצבי והפרעות מטבוליות. עם זאת, תהליך השיפוץ עצמו מעורר צלקות אפיגנטיות, והתרבות שלאחר מכן יכולה לשנות עוד את הספקטרום של תרופות נוגדות את ה-PTgenome (כלומר, מודל של תרבות אפיגנטית), החוקרים חייבים לקחת בחשבון שינויים אלה.

Biomanufacturing of Therapeutic Cells

(הייצור של תאים ב-T, MSCs, וטיפולים אחרים של תאים דורש מעקב ביולוגיים.סחף אפיגנטי במהלך תהליך זה יכול להוביל לזמינות אצווה-to-batch בעוצמה. ניטור בזמן אמת של סמנים אפיגנטיים מרכזיים (למשל, אפילציה של תאים אפילפטיים:0CTLA4FLT או FLT:2Fsay) הם גם כן, לדוגמה, כמו גם תאים טרנסג'נדרטיים (T2Fsy) כ-Fsay) כדי לשפר את ה-Fsy) כ-T4F7Fsy) כ-Factivation) כ-T.

אתגרים ושיקולים

למרות ההתקדמות, כמה מכשולים נשארים בתרגום הידע האפיגנטי לתוך תרגול תרבות שגרתית.

  • (FLT:0) וכדאיות על פני סוגי תאים ומקורות:ראה LT:1) אפיגנומים שונים בין תורמים, מקורות רקמות, ואפילו בין רבים שונים של סרום.זה מקשה על הקמת הנחיות תרבות אוניברסליות.
  • (FLT:0Technical Complex and Cost:FLT:1 מקיף ניתוח אפיגנטי (למשל, WGBS או ChIP-seq) נשאר יקר ודורש מומחיות ביו-אינפורמטיקה.זה מגביל את השימוש שלו במעבדות קטנות יותר או עבור בקרת איכות גבוהה. זול יותר, מהר יותר כמו MS-PCR הם מפותחים.
  • (FLT:0) חוסר יציבות אפיגנטית לאורך זמן: FIRLT:1 גם בתנאים מבוקרים, תאים ממשיכים לנסחף.לא ברור אם ניתן למנוע את הסחף הזה לחלוטין או רק להאט.
  • (ב) [ה]ההתערות [ה][דרוש מקור]] [ה]: [ה] [ה]]] [ה]]] [ה]]]] [הה]]]] [הההההההההההההההההההההההההההההההההההההההתמדהים של ה'] היא בלתי נמנעת.

כיוונים עתידיים: לקראת תרבות מתואמת באופן אפיגנטי

כמה דרכים מבטיחות הן באופק שיכול להפוך את התרבות התא לחיזוי ופיזיולוגי יותר.

(ב) [ה]: [ה] [ה]] [ה]] [ה] [ה]] [ה]] [ה]]] [ה]]] [ה]]][ה]]]] [ה]]] [הההה] [ה] [ה] [ה]] [ה]]] [הההה]]] [התחכמה] [התמ"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ה"ב[[ה"ב]]]]]]]]]]]]"ב[[ה"ב[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה[[ה

(FLT:0Microfluidic and דינמי תרבות: פיזור 1: ⁇ ⁇ s ⁇ s המספקים חומרים מזינים וחמצן מבוקרים, בשילוב עם גירוי מכני, יכול לשפר את האופי הדינמי של רקמות.מערכות אלה יכולות להפחית את הסחף האפיגנטי על ידי מתן רמזים פיזיולוגיים יותר.

(FLT:0Single-cell multi-omics:BuildFLT:1) אינטגרלינג נתונים אפיגנטיים עם תמלילים ופרוטמיקים ברמת התא הבודד יספק נוף הוליסטי של איך תנאי תרבות קובעים מצב תאים. גישה זו כבר חשפה תת-פופוריאציות נדירות בתרבויות תאי גזע עם פוטנציאל שונה מלוטש שונה.

(FLT:0) עריכת חומרים כמכשיר להנדסת תאים:FLT 1 במקום פשוט להתאים את תנאי התרבות, מדענים עשויים לתכנן ישירות מצבים אפיגנטיים הרצויים.לדוגמה, עריכת אפיגנומה יכול לשמש כדי לפתוח טראנס-לכאורה בגן פרו-ריאני לפני השתלת תאים, מבלי לשנות את הרצף של הדנ"א.

(FLT:0) אינטליגנציה מלאכותית ומודלים מנבאים: FIRLT:1) מודלים של למידת מכונות מאומן על נתונים גדולים של פרמטרים תרבותיים ופרופילים אפיגנטיים מקבילים יכולים לחזות את תנאי התרבות האופטימליים לסוג תאים נתון.זה יחליף אופטימיזציה של ניסוי וטרור ויאץ את התפתחות של מדיה חדשה.

מסקנה

אפיגנטיות אינן היבט היקפי של תרבות התא – היא מרכזית להבנת התנהגות התא (FLT:0in vitrophFLT:1 ; כל היבט של הסביבה התרבות, מן הנוקשות של המנה ועד לזמינות של חמצן, משאיר סימנים אפיגנטיים המעצבים ביטוי גנים וגורל תאים.

לקריאה נוספת על השיטות הטכניות והממצאים האחרונים, ראה ביקורות על תקנות (FLT:0) epigenetic in the Cellural CultureFLT:1 ו-FLT:2epigenetic ב bioprocessingFLT 3 (בנוסף, FLT:4 Roadmapgenomics Mapping ConsortiumFLT:5 מספק משאב מקיף עבור אפיגנטיקה שיכולה לסייע לתאים תואמים.