Cryo-electron microscopy (Cryo-EM) עיצב מחדש את הנוף של ביולוגיה מבנית, המציעה לחוקרים עדשות עוצמתיות לבחון מאקרומולקולות ביולוגיים במדינה שלהם, מושתתתתתת. על ידי השלמת הצורך של התגבשות, טכניקה זו פתחה תצוגות מפורטות של מכונות מולקולריות מורכבות שהיו בעבר בלתי נגישות.

מה זה Cryo-EM?

מיקרוסקופית Cryo-electron היא צורה של מיקרוסקופית אלקטרונים שידור שבו דגימות ביולוגיות קפואות במהירות בשכבה דקה של קרח vitremous.תהליך זה, הנקרא vitrification, משמר את ההידרומיות הילידים, שלמות מבנית, ותנאים תואמים של המולקולות.בניגוד ל- X-ray קריסטלוגרפיה, הדורשת גבישים מסודרים, או שחזור מגנטי גרעיני (NMR) דגימות, אשר הוא מוגבל לחלבון קמצמי, כמו גם חלבונים דינמית, כגון תמונות דינמית של , כגון סימפוניות, כגון אותנטיות אותנטיות אטומיות, כלומר, כולל תמונות אותנטיות של דינמית של אטומיות, כגון .

השיטה זכתה להכרה נרחבת לאחר 2013 כאשר גלאי אלקטרונים ישירים ותוכנה לעיבוד תמונות שיפרה את ההחלטה של מבני חלבון מעבר ל-3 אנגסטרום. בשנת 2017, פרס נובל לכימיה הוענק לז'אק דובצ'ט, ג'וש פרנק, וריצ'רד הנדרסון לפיתוח Cryo-EM, מלט מעמדו ככלי מהפכני בביולוגיה מבנית.

התקדמות טכנולוגית חדשה

בעשור האחרון, סדרה של חידושים הגדילה באופן דרמטי את ההחלטה, באמצעות לוח, ונגישות של Cryo-EM.ההתקדמות הפכה את מה שהיה פעם טכניקת נישה לשיטת ⁇ המשמשת מאות מעבדות ברחבי העולם.

אלקטרון Detectors

מצלמות CCD מסורתיות וסרט היו מוגבלות על ידי יעילות קוונטית נמוכה (DQE) ורעש משמעותי. גלאי אלקטרונים ישירים, כגון פלקון ו-K3, ללכוד ישירות אלקטרונים ללא מזחלת, המציע רגישות גבוהה ושיעורי קריאה מהירים. גלאיים אלה יכולים להקליט סרטים של אלקטרון אינטראקציה עם הדגימה, המאפשר תיקון של תנועה מושרה על ידי קרן ובחירת הדגימות הטובות ביותר ברזולוציה טובה יותר מאשר 2angs.

עיבוד תמונה מתקדם Algorithms

השדה ראה מהפכה בשיטות חישוביות, במיוחד באזורים של איסוף חלקיקים, היערכות וסיווג (FLT:0)Maximum-likelihoodFLT:1 גישות ו Bayesian inference, המיושמות בתוכניות כמו RELION, CryoSPARC ו- cisTEM, אפשרו עיבוד כמעט אוטומטי של נתונים גדולים.

חידושים וחדשנות

היערכות עקבית וחדשנית נותרה צוואר בקבוק עבור פרויקטים רבים.

  • (ב) .0)Graphene oxide ורשתות זהב:03:1 אלה מספקים שכבת תמיכה יציבה המפחיתה את התנועה המושרה על ידי קרן וטעינה חלקית.
  • (ב) ויקרא י"ד:2blot-free DevicesofFLT 3: 3 (למשל, Spotiton) המפחיתים את הפסולת המדגם ומשפרים את העקביות.
  • (FLT:0)Time-resolved Cryo-EMearFLT:1) באמצעות ערבוב מיקרו-השפעהי המאפשר שילוב מהיר של מגיבים לפני המרץ, לכידת מדינות ביניים ציניות.
  • (FLT:0) לוחות שלבאז' (שניהם וולטה ובסיס לייזר) אשר משפרים את הניגודים לחלקיקים קטנים יותר, ומאפשרים ניתוח ברזולוציה גבוהה של חלבונים תת- 100 kDa.

כלים אלה הופכים את Cryo-EM לנגיש יותר למטרות מאתגרות, כולל חלבונים קטנים של קרום ואזורים לא מופרכים.

אוטומציה וHigh- Throughput

מיקרוסקופים אלקטרונים מודרניים המצוידים בתוכנות איסוף נתונים אוטומטיות יכולים לאסוף עשרות אלפי מיקרוגרפים בין לילה, עם התערבות אנושית מינימלית.מערכות כמו EPU, Leginon ו-SerialEM לאפשר רכישה בלתי מושכת, וכלים חכמים לפני כן מעדכנים את ריבועי הרשת עם עובי קרח אופטימלי והתפלגות חלקיקים.אוטומציה זו אפשרה יוזמות גנטיות מבניות בקנה מידה גדול ואת האופי המהיר של חלבונים ויראליים במהלך התפרצויות.

השפעה על ביולוגיה סטרקטיבית

ההתקדמות ב Cryo-EM שינתה באופן יסודי את האופן שבו חוקרים חוקרים חוקרים חוקרים חוקרים חוקרים ממולקולות ביולוגיות.

חלבונים מנברנים וערוצי Ion

חלבונים ממוחניים הם קשים לשמצה להתגשם בשל האופי הידרופובי שלהם. Cryo-EM היה חזק במיוחד עבור לימוד קולטנים מקודמים G חלבון (GPCRs), ערוצי יון, מטענים, קולטנים מורכבים עם ligands או איתות של שותפים. לדוגמה, המבנה של ערוץ TRPV1 במדינות פונקציונליות מרובות להאיר את המנגנון של אלצהיימר, בדומה ל-multimicase, כלומר, כלומר, כלומר, כלומר, כלומר, כלומר, לדוגמה, אלצהיימר, כלומר, אלצהיימר, אלצהיימר, אלצהיימר, הוא היה הראשון, פתור, פתור, אלצהיימר, פתור, אלצהיימר, פתור, פתור, פתור, אלצהיימר, 1FV.

מכונות מקירומולקולריות גדולות

ריבומדומים, spliceosomes, proteasomes, ו assemblies גדולים אחרים נחקרו נרחב על ידי Cryo-EM.טכניקה מצטיין ב הדמיה של המורכבות האלה כי הם גדולים מספיק כדי ליצור ניגוד חזק יכול להיות מטוהר בצורות יציבות, פונקציונליות.הטבע הדינמי של ribosome במהלך התרגום נלכד ברזולוציה אטומית, מתן תמונות של גלגול אנטיביוטיקה, ותובנות ספציפיות התפתחות.

וירוסים וחלבון ויראלי

וירוסים הם מטרות טבעיות עבור Cryo-EM בגלל הגודל שלהם, הסימטריה, ואת החשיבות הביולוגית.הטכניקה שימשה כדי לקבוע את המבנים של וירוסים שלמים, כולל Zika, dengue, HIV, ו SARS-CoV-2 חלבון הספייקפי של SARS-CoV-2 נפתר בתוך שבועות של מגפת, מראה את ההתאמות שלה ואת האפטופים עבור נוגדנים ניטרליים.

ויזואליזציה של Dynamics ו-Conformational Ensembles

(ההתפתחויות האחרונות בעיבוד נתונים Cryo-EM מאפשרות לחוקרים לעבור מעבר למבנה סטטי יחיד.טכניקות כגון FLT:0) סיווג נתונים של Cryo-EM (FLT:1 ו-FLT:2multi-bodymentFLT 3:3 מתארות את השינויים התואמים המתמשכים של מולקולות.לדוגמה, לימוד הקרע במהלך מעברה מגלה כי בין היתר בפתרון של זמן-דלקתי, באמצעות מיקרו-אפקטיבי של דלקת לייזר, באמצעות מיקרו-דלקת-דלקת-דלקת-דלקת-דלקת-דלקת-דלקת-דלקת-דלקת-דלקת-דלקת-דלקת-דלקתית, ניתן לדלקתית, באמצעות כל חומר-דלקתית, באמצעות סימולציה בינונית זו, באמצעות סימולציה בינונית.

יישומים במחקר רפואי

היכולת של Cryo-EM לספק מבנים ברזולוציה גבוהה של חלבונים הקשורים למחלות ומורכבות בסביבות דמויי מולדתם הופכת אותו לכלי חיוני במחקר ביו-רפואי ופיתוח תרופות.

פיתוח החיסון

ההצלחה האחרונה הבולטת ביותר היא התפקיד של Cryo-EM בפיתוח חיסונים נגד SARS-CoV-2, המבנה של חלבון הספייק ההיתוך, ייצוב על ידי מוטציות פרוליין (S-2P), נפתר באמצעות Cryo-EM והפך לאנטיגן עבור נוגדנים מודרניים ו- Pfizer-BioNTech mRNA. גישה זו הורחבה לנגיפים אחרים, כולל וירוסים סינכרומטיים (V) אשר שימשו באופן נרחב לחיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד החיסון נגד ייצוב.

גילוי סמים ועיצוב תרופות מבוסס מבנה

[Woo-EM] הופך את צינור גילוי התרופה על ידי מתן מפות מפורטות של מטרות סמים במתחם עם מועמדים פוטנציאליים.בניגוד לקריסטל רנטגן, אשר לעתים קרובות דורש ספוג או co-crystallization עם מולקולות קטנות, Cryo-EM יכול לדמיין תרופות מחייבות ישירות בהקשר של חלבון באורך מלא, לעתים קרובות ברזולוציה ליד atomic.

חברות תרופות מסתמכות יותר ויותר על Cryo-EM עבור סקר שמפוצל, שבו ספריות מולקולה קטנות שקועות בדגימות חלבון ומבנים רבים ברזולוציה נמוכה נפתרים כדי לזהות להיטים. גישה זו יכולה להיות מהירה יותר מאשר שיטות סינון מסורתיות ומספקת מידע מבני ישיר על אתרים מחייבים.הטכניקה הוחלפה גם על מנת ללמוד את החייב של נוגדנים למטרות קשות, כגון קולטנים מקודמים של חלבון, המאפשרים ביולוגיים.

מחלות גנטיות וקטנות

מוכות משבשות את המבנה והתפקוד של חלבונים לעתים קרובות להוביל להפרעות גנטיות. Cryo-EM מאפשר לחוקרים להשוות את הארכיטקטורה של חלבונים מסוג פרוע ומוטאנט, לחשוף את הבסיס המכני של המחלה.לדוגמה, מחקרים מבניים של הסיציסטיק פיברוזיס טרנסמברנס (CFTR) באמצעות Cryo-EM הראו כיצד מוטציות מסוימות (למשל, F8del) משפיעות על גירוי עצבית ומניעת גירוי פונקציונליות של צוואר הרחם.

התנגדות אנטימיקרוביאלית

האיום העולה של חיידקים עמידים אנטיביוטיקה עורר עניין בשימוש Cryo-EM כדי לעצב נוגדנים חדשים.מבנה של חיידקיים עם אנטיביוטיקה מרובות חשפו מנגנונים של התנגדות וספק תבניות לשינוי תרופות קיימות. Cryo-EM כבר הוחל גם ללמוד משאבות נצלניות חיידקיות, כגון מערכת AcrAB-TolC, ו כדי לדמיין את ההרכבה של מנגנונים חדשים לפיתוח מנגנונים.

כיוונים עתידיים

קצב החדשנות הטכנולוגית ב Cryo-EM אינו מראה סימנים להאטה.כמה מגמות מתעוררות מבטיחות להרחיב עוד יותר את התועלת במחקר וברפואה.

שילוב עם בינה מלאכותית

למידת מכונה ו- AI משולבים בכל שלב של זרימת העבודה Cryo-EM. שיטות למידה מעמיקות יכולות כעת לחזות עמדות חלקיקים, להעריך פרמטרים CTF, ולגוון מיקרוגרפים עם דיוק מדהים.אולי המרגש ביותר הוא השימוש באלגוריתמים מתקדמים כדי לשחזר מפות צפיפות מהנתונים רועשים, המאפשרות מפות רזולוציה גבוהה יותר מפחות חלקיקים.

Cryo-Electron Tomography (Cryo-ET)

בעוד שרק חלקיקים Cryo-EM ממוצעים אלפי מולקולות זהות, פורנוגרפיה Cryo-electron (cryo-ET) תמונות אובייקטים ייחודיים, כגון אבראלס, וירוסים, ומבנים סלולריים, בשלושה ממדים. Advances in Stage Plates, מסננים אנרגיה וגלאים ישירים מאפשרים להשיג פתרון תת-מטר ב situ.o-ET שימש כדי לדמיין את הארכיטקטורה של תאים מתפתלים בתוך תא הרחם.

High- Throughput and Automation for Structural Genomics

מאמצים בקנה מידה גדול לקבוע את המבנים של כל החלבונים האנושיים או כל החלבונים בפתגן הופכים להיות אפשריים הודות לאוטומציה.מתקנים כמו FLT:0 National Cryo-EM FacilityFLT:1 במעבדה הלאומית פרדריק ו-FLT:2eBICFLT 3: בבריטניה מספקים גישה גבוהה למיקרוסקופים ומחשוב בשילוב עם התקדמות בדגימה, ייתכן שסביר להניח שאלפי מחקרים גנטיים אפשריים.

ב-Situ Structural Biology

שמירה על חלבונים ישירות בסביבה התאית שלהם היא המטרה הסופית של ביולוגיה מבנית. Cryo-ET, בשילוב עם הכנה מתקדמת lamella באמצעות קרן יון ממוקדת (FIB), עכשיו מאפשר לחוקרים לצלם חלבונים בתאים עבים ורקמות. גישה זו כבר חשפה כיצד נקבוביות גרעיניות, סנטומדומים, ו ribosomes מאורגנים בקונטקסטים עתידיים גלאיים ומהירות גבוהה יותר:

שילוב Cryo-EM עם טכניקות אחרות

שיטות היברידיות המשלבות Cryo-EM עם ספקטרומטריה המונית, crosslinking, ומודל חישובי (למשל, AlphaFold) הופכות לסטנדרט.לדוגמה, crosslinking מסה ספקטרוםמטריה (XL-MS) מספק מגבלות מרחק המסייעות לבנות מודלים פסאודו-אטומיים למפות Cry-EM בינוניות.Alphao-EM.Alphafold2 יכול ליצור חיזוי מדויק של דומיינים כי הם מתאימים במיוחד עבור כל האינטראקציות מורכבות.

מסקנה

ההתקדמות במיקרוסקופיות Cryo-electron מהפכה בביולוגיה מבנית ומחקר רפואי.היכולת לדמיין מולקולות ביולוגיות ברזולוציה ליד atomic ללא התגבשות פתחה מעמדות שלמים של מטרות - חלבונים ממוחנים, אסיפות גדולות ווירוסים - כדי לשפר את ההתפתחות הביולוגית של הגלאים, אלגוריתמים, הכנת הדגימה דחקו את גבולות ההחלטה והקט, בעוד שטכניקות כמו אינסטגרם-Industryo-Into-Innerance, הפכו ל-Industryology המודרנית, הן יצירתיות, המשך פעילות גופנית-Intativealology, המשך פיתוח אנטי-Intel-Intel-Intology.