באמצעות הקרנה גבוהה (HTS) הפך אבן הפינה של מחקר התרבות המודרנית של תאים, המאפשר למדענים להעריך באופן שיטתי אלפיים של פרקטיקות, הפרעות גנטיות, או תנאים ביולוגיים בניסוי יחיד.על ידי שילוב של אוטומציה, miniaturization וטכנולוגיות זיהוי מתקדמות, HTS מאיצה את זיהוי של מולקולות ביואקטיביות, פונקציות גנטיות ומנגנוני מחלה.

מה זה High-Comput Screening?

בדיקה גבוהה באמצעות חישוב היא שיטה המאפשרת בדיקות מהירות של מספר גדול של דגימות ביולוגיות או תרכובות כימיות באמצעות ציוד אוטומטי עיבוד מקבילים.עיקרון הליבה הוא miniaturization: assays מבוצעים בלוחות מיקרו-טרטרי המכיל 96, 384, 1536, או אפילו 3456 בארות, המאפשרות אלפי ניסויים כדי להפעיל במקביל.

השורשים של HTS מתוארכים בשנות ה-80 וה-90, כאשר חברות התרופות החלו לאוטומט תהליכי ההקרנה שלהם כדי להגדיל את השימוש ב-Spot ולהפחית עלויות. מערכות מוקדמות התבססו על מדד צבע או רדיומטרי פשוט, אך HTS מודרני משתמש במערך רחב של טכנולוגיות זיהוי, כולל עוצמת שפעת וצמצום, משך זמן של שטף (TRF), או קיטוב (F), או קלקולציה (F), או תכנות יתר של חלבון כימי), כמו הדבקה של חלבון מיקרו-מנטליגנטי, כמו הדבקה חד-מנטליגנטיבנדרלטרה-מנטלית-מנטלי (דלקת-מנטלית-מנטלי) עם רמות מיקרוסקופית (דלקת-מנטליות-מנטליות-מנטליות-מנטליות-מנטליות-מנטליות-מנטליות-מנטליות-מנטליות-מנטליות-מהפכה) עם רמות-מהפכה-מהפכה-מהפכה בעלת טווח (דלקת-מנטליות-מהפכה בעלת טווח חזק יותר, כמו: עודף-מהפכה בעלת עוצמה) עם שינויים בחלבון, כמו אפילפטית-מהפכה בעלת טווח (דלקת-מהפכה) עם רמות-מהפכה בעלת עוצמה של חלבון-מהפכה בעלת עוצמה, כמו

המונחים: HTS Workflow

יישום HTS בתרבות התא כרוך שילוב של כמה מרכיבים קריטיים, כל אחד מהם חייב להיות אופטימיזציה בזהירות כדי להבטיח איכות נתונים והתאמה מחדש. זרימת העבודה יכולה להיות שבורה לארבעה עמודי עמוד עיקריים: עיצוב, אופטימיזציה של תרבות תאים, אוטומציה וטיפול נוזלי, וזיהוי וניתוח נתונים.

המונחים Design and Development

הצלחתו של כל קמפיין HTS תלויה באיכות ה-Assay המשמש למדידת התגובה הביולוגית של העניין.

  • (ב) פורמט:0 (Assay: ⁇ FLT:1 , Homogeneous (תערובת לקריאה) הם מועדים למהירות, בעוד שצעדי כביסה עשויים להיות הכרחיים עבור נקודות קצה מסוימות (למשל, אליזה מבוססת קריאה).
  • יחס של תפוצה:0 (Signal-to-noise): ⁇ 1 (הכפירה חייבת לייצר אות חזק, הדדי שניתן להבחין בו באופן אמין מהרקע.הספק, מדד סטטיסטי של איכות כאמור, צריך לעלות באופן אידיאלי על 0.5 עבור מסך טוב.
  • (ב) ⁇ :0) טווח דינמי: FLT:1 ה-Assay צריך לתפוס מגוון רחב של תגובות, מעיכוב מלא הפעלה מקסימלית, ללא משיכה גבוהה או ריקנות גבוהה.
  • (FLT:0Cell סוג ודחיסות רואה:FreaLT:1) הבחירה של קו תאים (primary, אלמוות, או תא גזע -derived) ו צפיפות הראייה אופטימלית חייב להיות נחוש באופן אמפירי.
  • (FLT:0) משך הזמן והבקרות: FIRLT:1) לקבוע את נקודת הזמן האופטימלית לקריאה לאחר תוספת מורכבת.מנע בקרה חיובית (תרכובות פעילות ידועות), בקרה שלילית (צמחים), ותוספות ללעג כדי להעריך אפקטים הצלחת.

עבור מסכים גנטיים באמצעות ספריות CRISPR או RNAi, עיצוב Assay חייב גם לקחת בחשבון עבור הדבקה או יעילות ניכוי, ריבוי זיהום, ובחירת של RNAs או אחנ"נ.טייסים באמצעות תת-קבוצה קטנה של הספרייה הם חיוניים כדי לאמת את ההערה לפני הגדלה.

אופטימיזציה של תנאי תרבות תאים

תרבויות תאים עקביות ובריאות הן הבסיס של השתנות ה-HTS. בצמיחה התאית, הכדאיות או התגובה יכולים להציג רעש כי מסיכות להיטים אמיתיים.

  • (FLT:0Cell Culture Media andתוספים:FLT:1) השתמש בחבילות סטנדרטיות, מאומתות של מדיה, סרום וגורמים צמיחה.S Serum-to-lot יכול להשפיע על התנהגות התא; לשקול שימוש באמצעי תקשורת מוגדרים, ללא סרום כאשר ניתן.
  • (FLT:0)Plate ציפוי ומשטח:FLT:1 עבור תאים דבקים, ציפוי צלחת (למשל, פולי-D-lysine, קולגן, או fibronectin) עשוי להיות נדרש כדי לקדם קבצים מצורפים אחידים.
  • (FLT:0) תנאי שימור: FLT:1ve לשמור על שליטה קפדנית של הטמפרטורה (3 ° C), רמת CO2 (5%), ולחות במהלך הכנת הצלחת ו incubation. Evaporation היא בעיה עיקרית ב 384- 1536-well צלחות; השתמש בחיתולים לימוזינה או בקובטורים מחונמים.
  • (FLT:0)Cell מעבר מספר ו-Synכרוניזציה: ibph:1) השתמש בתאים במספר מעבר עקבי (למשל, מעבר 5-15 לקווים אלמוות רבים) ו מסנכרנים אותם (למשל, רעב בסרום) אם ה-Assay הוא מחזור תא-תלוי.
  • (FLT:0) ספירת תאים וניתוק:FLT 1 מעסיק ניגודים אוטומטיים (למשל, לנסות להרחיב את התפוצה הכחולה, הדמיה בשדה בהיר) כדי להבטיח צפיפות אחידה על פני צלחות. צינורות רב ערוצים או מטפלות נוזלי יכול לקלקל תאים אפילו, אבל קלמנט הוא קריטי להימנע מאפקטים.

ביצוע מחקר אופטימיזציה מעמיק עם מסך לעג (באמצעות רק בקרות) יכול לעזור לזהות ולסלק מקורות של וריאציות לפני ביצוע הספרייה המלאה.

אוטומציה ודלק

אוטומציה היא עמוד השדרה של מטפלים נוזליים רובוטיים, מחצני צלחת, incubators, וקוראים משולבים לתוך זרימת עבודה שיכולה לעבד מאות צלחות ביום.

  • (FLT:0 Throughput and Speed: FLT:1) בחר מטפל נוזלי העומד בראש סדר היום שלך.מעבדות בעלות נמוכה יכולות להשתמש בניכוי חד פעמי, בעוד מעבדה עשירה בכול גבוה דורשת 384 עד 1536 מערכות ערוצים.
  • (FLT:0) עדיפות ודיוק: FLT:1, שגיאה פירעון (CV) צריך להיות מתחת 5% עבור רוב ה- HTS כפי שמעידים. ⁇ רגילה ובדיקת איכות טיפ הם הכרחיים.
  • (FLT:0)Plate Treatment andתזמון:FLT:1eurs for Time-רגישים (למשל, קריאה קינטית), תוכנת תזמון אוטומטית יכולה לתאם העברות נוזליות, בידוד וגילוי כדי לשמור על תזמון עקבי על פני צלחות.
  • (FLT:0) אינטגרציה עם גלאי: פלאנט 1 (FIRLT 1) קוראי לוח ודימויים חייבים להיות תואמים עם פורמט הצלחת ו-Assay type.קוראים מודרניים רבים תומכים הן נקודות קצה והן בקריאה קינטית, עם מצבי זיהוי מרובים.

עבור מעבדות חדשות HTS, להתחיל עם מערכת למחצה-אוטומטית: פורמט צלחת 96-well עם צינור רב ערוצים ידני עבור אופטימיזציה מוקדמת, ואז בקנה מידה עד 384-well צלחת עם מטפל פשוט נוזל. אינטגרציה רובוטית מלאה ניתן להוסיף מאוחר יותר כמו דרישות דרךput לגדול.

שיטות זיהוי ואוסף נתונים

בחירת הקריאה קובעת את סוג המידע המתקבל.שיטות זיהוי נפוצות ב- HTS מבוסס תאים כוללים:

  • (FLT:0) עוצמת ההתבגרות (FI): FIRLT:1 שימש עבור אסימונים מדידה של פעילות אנזים, מחייב קולטן או ביטוי גנים (למשל, כתבי GFP).
  • (FLT:0)Luminescence:FLT:1 Firefly או רן לוציפרז אומר עבור יכולת התא (תוכןATP) או פעילות הגן של הכתב.
  • (FLT:0) stemp-resolved fluorescence (TRF) ו FRET:03FLT:1 הקטנת רקע מ autofluorescence ופיזור אור. Common for kinase Assays and חלבון-חלבון מחקרים אינטראקציה.
  • (FLT:0) דימות תוכן גבוה: 1.FLT 1 משתמש מיקרוסקופיה אוטומטית כדי ללכוד ערוצי פלואורסנס מרובים באופן טוב.אנליזה של מיתול, מורפולוגיה תאים, ו heterogeneity האוכלוסייה - נתונים כי קוראי לוח קצה לא יכולים לספק.

איסוף נתונים צריך לכלול לא רק את ה- Readout הראשי אבל גם מדדים בקרת איכות (למשל, ספירת תאים לבאר, אחידות צלחת) לאחסן נתונים גולמיים בפורמט מובנה (למשל, HDF5) ולהשתמש בתוכנה כדי לחשב את הגורמים Z, אחוז מעכב, ומשמעות סטטיסטית. Open-source כלים כמו R ו- Python (עם חבילות כגון "plats" או "data") הם יותר ויותר פופולריים, פלטפורמות טלוויזיה).

יישום HTS במעבדה שלך: מפת דרכים מעשית

להביא HTS לתוך מעבדה תרבות תאים דורש גישה מגובשת למזער סיכון ולהבטיח הצלחה. להלן הוא מדריך צעד אחר צעד.

שלב 1: הערכה ותכנון

Define the Scientific Question and the scale of Screen Need.האם תמסך ספרייה ממוקדת קטנה (למשל 2,000 תרכובות) או ספריית CRISPR גנום (למשל, 100,000 + מדריכים)?להעריך את מספר הלוחות, העדינים, ואת זמן הטכנאי עבור ציוד (מנהלת חשאית, קורא), ניתנותנותנות (plates, טיפים), ותוכנות עם מידע זמין עם אוטומציה או נתונים.

שלב 2: Assay Miniaturization and אימות

קנה מידה של ה- Assay מ צלחת 96-well קונבנציונלית לתבנית היעד (384- 1536-well) מספר תאים מכוונן, כרכים חוזרים וזמני הדגימה באופן יחסי.ריץ מסך טייס באמצעות קבוצה של 100-500 תרכובות ידועות (כולל בקרה חיובית ושלילית) כדי להעריך את הגורם Z, אחוזי זיהוי וקצב חיובי כוזב. Aim for a Z> קיבולת מקובלת <0 מעלות צלזיוס 10%).

שלב 3: אוטומציה של עיבוד ובדיקה

לכתוב ולבדוק פרוטוקולים אוטומטיים להצגת תאים, תוספת מורכבת, שילוב, זיהוי וגילוי. להפעיל "מסך מבחן" קטן של 10-20 צלחות כדי לאשר דיוק טיפול נוזלי, תזמון ושילוב תוכנה. השתמש בבדיקה זו כדי לזהות צווארי בקבוק (למשל, כביסה איטית, מהירות הקורא לא מספיק) ולהתאים בהתאם.

שלב 4: ביצוע מסך מלא

בצע את המסך הראשי עם הספרייה המלאה. לוחיות תהליכים ב אצווה, בין לוחות הבקרה (עם מעכבים ידועים או פועלים) כדי לפקח על יציבות כאמור לאורך זמן. להקליט מפות לוחיות ו metadata עבור מעקב.אם המסך לוקח מספר ימים, להקפיא מלאי תאים במספרים קבועים כדי להימנע מסחף.

שלב 5: היכה אי-הזדהות ואימות

לאחר איסוף נתונים, החל מסננים בקרת איכות: להסיר צלחות עם Z's FLT:0 3).לתת להיטים ב- ASSA משני באמצעות מניות תרכובות טריות וקריאה אורטוקונאלית (למשל, נפיחות מערבית, qPCR) כדי לאשר את מעורבות המטרה.

Best Practices for Robust HTS

שמירה על שיטות מוכחות הטוב ביותר יכול לשפר באופן דרמטי את שיעור ההצלחה של מסעות ה-HTS.ההנחיות הבאות מוכרות מאוד בתחום:

  • (FLT:0) Use באיכות גבוהה assay: סוללת ההרחבה 1 (Llow-binding), לוחיות ברורות אופטיות להפחית רקע ולשפר אחידות. לוחיות לבנות הן הטובות ביותר עבור luminescence, בעוד צלחות שחורות להפחית את המעבר ב פלואורסנס.
  • (FLT:0) השפעות קצה של קצה:FLT:1ir; השורות החיצוניות ביותר ועמודות של לוחות מיקרוטטר לעתים קרובות להציג צמיחה תאים שונים או שיעורי evaporation. Fill Edges עם בינוני או להשתמש הצלחות עם טבעות condensation. אלגוריתמים נורמליזציה (למשל, תיקון מדיה חכמים צלחת) יכול גם לפצות.
  • (FLT:0) מעסיק מדדים סטטיסטיים חזקים: FLT:1 מעבר לגורם Z, לחשב את יחס האות-to- ⁇ (S/B) ואת coefficient of Variation (CV) עבור בקרות. Monitor אלה מטריה מטריים על לוח הזמנים לאורך המסך ודגל כל צלחת אשר deviates.
  • (FLT:0) לכלול די לשכפלות: FLT1) כל מצב לפחות בשכפלה (עדיף טיול) לשלוט על יכולת טכנית. עבור מסכים גנטיים, להשתמש במספר RNAs עצמאי לגן כדי להפחית את ההשפעות של target.
  • (FLT:0) ביצוע הכל: FLT:1 לשמור מחברת מעבדה אלקטרונית עם פרוטוקולים, מפות צלחת ופרמטרים ניתוח נתונים.זה מבטיח שיפור וחיזוק בעיות עתידיות.

משאב שימושי עבור מדדי איכות HTS הוא ה-FLT:0NIH Assay GuidanceFLT:1, אשר מספק פרוטוקולים מפורטים לפיתוח ואימות.

אתגרים משותפים ב-HTS וכיצד להתגבר על

למרות תכנון זהיר, פרויקטים HTS נתקלים לעתים קרובות מכשולים שיכולים לפגוע התקדמות.מודעות לאתגרים אלה מאפשרת הפחתה פעילה.

עלויות גבוהות ועוצמה משאבים

HTS דורש השקעה משמעותית בציוד, קונסולות, וצוות. ספריות מורכבות לבד יכול לעלות עשרות אלפי דולרים.כדי להפחית עלויות, להתחיל עם ספרייה קטנה וממוקדת (למשל, תרופות שאושרו על ידי ה- FDA או ביואקטיבים ידועים) לפני הרחבת השימוש במיניטוריזציה (384- 1536-well) כדי להפחית את הצריכה המחודשת.

ניהול נתונים ואנליזה מורכבות

אחד HTS יכול לייצר terabytes של נתונים תמונה או מיליוני נקודות נתונים.ללא צינור ניהול נתונים חזק, ניתוח הופך צוואר בקבוק. להשקיע במערכת ניהול מידע מעבדה (LIMS) כדי לעקוב אחר דגימות, צלחות, ותוצאות. השתמש באחסון מבוסס ענן ומשאבים עבור נתונים גדולים.צוות רכבת תכנות סטטיסטית (R, Python) כדי להתאים את עצמו לנרמליזציה ו-out בחירה.

חיובי כוזב ושלילים שקריים

חיובי כוזב נובע ממודולציה מורכבת, ggregation, או cytotoxicity שלא קשורה למטרה. שלילית כוזבת יכול להתרחש אם ה- Assay הוא חסר רגישות או אם תרכובות degrade. Mitigate אלה על ידי: (1) כולל בקרת quench פלואורנס, (2) בדיקות תרכובות בריכוזים מרובים (HTS הוא לעתים קרובות חד-ריכוז יחיד, אבל מעקב אחר מינון הוא חיוני), באמצעות בדיקות כוזבות או אימות של סרטן; כמו גם שימוש ב-וירוסים;

קו תאים ו-Assay Variability

אפילו קווי תאים יציבים נסחפו לאורך זמן.בדרך כלל לפקח על תאים מכפילים זמן, מורפולוגיה, וביטוי סימון. להקפיא הרבה תאים במעבר נמוך ולהרחיב טרי עבור כל מסך.אם באמצעות תאים ראשוניים, סטנדרטיזציה של פרוטוקולים בידוד ותרבותיים על פני תורמים.עבור תאים תאי גזע-דרטיביים, להבדיל בכמויות גדולות ומאפיינים טוהר לפני שרואים.

כיוונים עתידיים ב High-באמצעות חישוב תרבות תאים

HTS ממשיך להתפתח, מונע על ידי התקדמות טכנולוגית ותובנות ביולוגיות חדשות.כמה מגמות מתעוררות מעצבות את הדור הבא של מסך מבוסס תאים:

  • (FLT:0) תרבות תא ואיברים: ההרחבה 1 (איור 1) מסורתי 2D מונוlayers לעתים קרובות מטעה בפיזיולוגיה vivo. HTS תואמים 3D מודלים (spheroids, Organoids, שבבים מיקרו-קלידיים) מפותחים, אם כי הם דורשים הסתגלות לטיפול הדמיה ונוזל.
  • (FLT:0) אינטליגנציה מלאכותית ולמידה של מכונה: אלגוריתמים 1 AI משמשים כעת לייעל את התנאים כאמור, לחזות תרכובות להיט, ולנתח תמונות תוכן גבוהות. Deep Learning יכול לחלק תאים, לסווג phenotypes, ולזהות תשובות עדינות כי סטטיסטיקות קונבנציונליות מפספסות.
  • (FLT:0) ,Pooled CRISPR מסכים עם קוראי תאים בודדים: FIRLT:1 משלב ספריות CRISPR עם RNA יחיד RNA ריצוף (למשל, Perturb-seq) או Proteomics (למשל, Epi-TOF) מאפשר לימודי פונקציונליים בקנה מידה גנום ברזולוציה חסרת תקדים.
  • (FLT:0) Live-cell דינמית סקר: FLT:1ir במקום מדידות נקודות קצה, ניטור מתמשך באמצעות כתבים פלואורסנט מאפשר לחוקרים לעקוב אחר תגובות סלולריות במשך שעות או ימים, לחשוף דינמיקה זמנית של פעולה בסמים.
  • (FLT:0) תאים מאודרים למטופל: איור FLT ( 1:1) באמצעות תאי גידול מאודרים לחולה או נוירונים iPSC-derived הופכים נפוצים יותר, נעים HTS לכיוון רפואה אישית.

לקריאה נוספת על עקרונות ה-HTS אוטומציה ו-Assay, מומלץ להתייעץ עם משאבים מ-FLT:0 (המכונים:0) Thermo Fisher ScientificcioFLT:1 ו-FLT:2Corning Life SciencesFLT 3

מסקנה

יישום בדיקות מהירות במחקר תרבות התא הוא צעד טרנספורמטיבי שיכול להאיץ באופן דרמטי את קצב הגילוי בפיתוח סמים, גנומיקים פונקציונליים, וביולוגיה בסיסית.הצלחה תלויה בגישה שיטתית: תכנון אסיעה חזקה, אופטימיזציה של תנאי תרבות התא, שילוב אוטומציה מתאימה, וליישם ניתוח נתונים קפדני יותר. בעוד אתגרים כגון עלות, נתונים, ו- Assay variability הם משמעותיים, הם יכולים להיות זהירים באמצעות טכנולוגיות סלולריות, כולל שיטות פעולה מתקדמות יותר ויותר, כולל טיפוליות של תאים.