תאי גזע עצביים (NSCs) הם תאים מתחדשים, רב-פוטנטיים אשר מביאים את סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים המרכזית: נוירונים, אסטרוציטים, וoligodendrocytes.היכולת הייחודית שלהם לפרו-חיים ולבדל הופכת אותם כלים חיוניים עבור ביולוגיה התפתחותית, מודלים, בדיקות סמים, ורפואה רגנרטיבית.

הבנה של Neural Stem Cell Biology ומקורות

NSCs יכול להיות מבודד מן העובר, עוברי, או רקמות עצביות בוגר. Embryonic NSCs נגזר מן הטלנספאון או חוט השדרה להציג את הפוטנציאל ההסתברותי הגבוה ביותר, בעוד NSCs מבוגר מאזור תת-קרקעי או hippous להציג צמיחה מוגבלת יותר. induced pluripotent תא גזע (iPSC)-derive NSC מציעים סקאלה, ללא קשר לתרבויות ספציפיות, ללא קשר.

סמנים מרכזיים לאופי NSCs כוללים את נסקין, Sox2, ו- Pax6 עבור מבשרי עצביים, ו- GFAP עבור תאים דמויי רדיוה-glia בבוגר.תרבות מוצלחת שומרת ביטוי גבוה של סמנים אלה עם ביטוי מינימלי של סמנים ספציפיים קואג' כגון TUJ1 (neurons) או O4 (oligodenrocytes).

המונחים: environmental Parameters

טמפרטורה ו- pH יציבות

NSCs בדרך כלל תרבות ב 3 ° C במטען מחונן עם 5% CO2. רמת CO2 עובד עם מערכת buffer bicarbonate במדיום כדי לשמור על pH של 7.2 -7.4. פתחי דלת תדירות או תנודות ב CO2 יכול לגרום שינויים pH כי הלחץ את התאים, המוביל כדי להפחית את הכדאיות.

חמצן Tension

חומרים סטנדרטיים פועלים בחמצן אטמוספרי ( ⁇ 20% O2), אך רמות חמצן פיזיולוגיות בטווח המוח המתפתח והבוגר מ-1% ל-5%.טיפוח NSC בתנאים היפותקסיים (2–5% O2) הוכחו כדי לשפר את ההתפשטות, להפחית את הלחץ החמצןי, ולשמור על תאי hypoxics ייעודיים או 3-gas incubators יכול לספק עקביות נמוכה-oxy עבור המולקולות, כגון תרכובות נוגדות חמצון, כגון ויטמין Axics.

הומור וחילופי גז

לחות גבוהה ( ⁇ 95%) מונעת evaporation של מדיום תרבות, אשר בדרך כלל מוביל לריכוזים מוגברים וריון אשר פוגעים בצמיחה התא. רבים המרכיבים כוללים מחבת מים, וזה קריטי לפקח על רמות מים ולהחליפם במים סטריליים באופן קבוע.

קומפוזיציה ונוסחאות

הבחירה של מדיום ביזל ותוספי השפעה עמוקה על התנהגות NSC.הנוסחאות הנפוצות ביותר הן בינוני נוירובסאלי (מתפתח עבור נוירונים ראשוניים) ו DMEM/F12 (תערובת 1:1 של Dulbecco's Modified Eagle Medium ו-F12 של Ham's F12). שניהם מספקים חומצות אמינו חיוניות, ויטמינים וגלוקוז.

⁇ Media

  • (FLT:0)Neurobasal MediumFLT:1 , מכיל רמות נמוכות יותר של גלוטמין וריכוזים גבוהים יותר של תוספי B27 שנועדו לתרבויות עצביות.זה משמש לעתים קרובות עבור לאחר השמדה אבל יכול להיות מותאם עבור תחזוקה NSC בשילוב עם גורמי צמיחה.
  • (FLT:0)DMEM/F12FLT:1 , Richer בחומרים מזינים ומשמש בדרך כלל לתרבויות NSC של העובר וה-IPSC-derived NSC. רבים פרסמו פרוטוקולים לתרבויות הנוירוספירה ותרבויות מונו-שכבות מעדיפים DMEM/F12 כבסיס.
  • (FLT:0) פורמולציות שלCustom Formulations: 1 (ב) - כמה מעבדות לפתח תקשורת ללא סרום, מוגדרת עם ריכוזים מבוקרים של אינסולין, העברה, סלניום ופרוגסטרון (למשל, N2 או B27).

גורמי צמיחה

שני הmitogens הקריטיים לתרבות NSC הם גורם צמיחה אפידרמל (EGF) וגורם צמיחה בסיסי fibroblast (bFGF או FGF-2) הוסיף בדרך כלל ב 10-20 ng / mL כל אחד, הם מפעילים קולטן צמיגים צמיגיםrosine kinases כי לקדם כניסה מחזור תאים ולמנוע אפופטוזיס. כמה פרוטוקולים להשתמש רק גורם אחד, אבל שילוב בדרך כלל נכנע גבוה יותר ל-פוחיות.

סרום ותוספים

סרום פניית (FBS) הוא FLT:0 (לא מומלץ) 1 לשמירת NSCs לא אדישים כי הוא מכיל גורמים שונים של הפחתה.

  • (FLT:0B27 תוספת FLT:1 (50×) - מכיל נוגדי חמצון (קטאלז, דיסמוטאז, חומצות שומן והורמונים.זה פותח במקור להישרדות עצבית אבל עובד טוב עבור התרחבות NSC בשילוב עם גורמי צמיחה.
  • (FLT:0)N2miaFLT:1 (100×) - מכיל אינסולין, העברה, פרוגסטרון, עקרות, ו סלניט.זה פחות מורכב מ B27 והוא משמש לעתים קרובות עם DMEM / F12 לתרבות הנוירוספירה.
  • (ב) [ה]] [ה]] [ה]]] [ה]]] [ה]]][2] ל-L-glutamideFLT:] – גטמין הוא חיוני למטבוליזם התא, אך מפלס מעל הזמן; גלוקוזטמקס מספק צורה יציבה יותר של דיפלופטיד.

אנטיביוטיקה ואנטיביוטיקה

השימוש ב-Pliicillin-streptomycin (100 U / mL) נפוץ, אבל חשיפה ממושכת יכולה מסיכה זיהום ועלול להשפיע על התנהגות תאים.עבור ניסויים קריטיים, לשקול תרבויות ללא אנטיביוטיקה עם טכניקה אסימפטטית קפדנית.אם זיהום פטרייתי הוא סיכון, amphotericin B או פטריות ניתן להוסיף, אבל תרכובות אלה יכולים להיות רעילים ל- NSC בריכוזים גבוהים.

אופטימיזציה של Surface Optimization

תרבות Monolayer

עבור תרבויות NSC דבקים משטח כדי לקדם את ההחזקה התאית להישרדות.סטנדרט הזהב הוא ציפוי שווה עם FLT:0poly-L-ornithine (PLO)FLT:1 ואחריו FLT:2lamininnin-Lbreation) עם זאת, 000 ליטרים אופייניים (Lubmin) ו-L-Lubin-Lubmind) עם זאת, 000 ליטרים אופייניים (L-L-L-L-L-L-L-L-L-L-L-L-L-L-Lubmin)).

ניתן להחליף את ה-Samsectin או Matrigel, אבל אלה מציגים רכיבים בלתי מוגדרים.עבור בדיקות מהירות, משטחים סינטטיים של peptide-coated (למשל, עם RGD או IKVAV מוטיבים) מפותחים.

תרבות נוירוספירה 3-Dimensional Neurosphere

נוירופרנציות הן מצרך חופשי של NSCs אשר אינם דורשים תת-קרקעית.מערכת זו מועילה לשמירה על צמח ועל הרחבה משובצת.עם זאת, נוירוספרים יכולים לפתח מרכזי ערפילית אם הם גדלים גדולים מדי (>200 מיקרומטר בקוטר) כדי להימנע מספירות אלה, דיסוציאט כל 5-7 ימים באמצעות שיטות אננזיות (Acase או מנסה μin) להיות מעבר מכני עדינה ל קיבולת קיבולת קיבולת .

Scaffolds ו- Hydrogels

עבור יישומי הנדסת רקמות, NSCs הם לעתים קרובות מוטבעת ב biomimetic scaffolds כגון alginate, קולגן, או חומצה היאלורונית הידרוגלילs. אלה 3D סביבות טוב יותר recapitulate את הממטריקס חוץ סלולרי יכול להיות מכוון לנוקשות, porosity, ו ligand מצגת. נוקשות עבור תרבות NSC הוא בדרך כלל בטווח של 1Pasterre, לחקות סטריקנות.

שמירה על סטיות ומניעת הבחנה ספונטנית

אסטרטגיה משלימה

NSCs צריך לעבור על 70-80% זיהום (monolayer) או כאשר נוירוספרים מגיעים 150-200 מיקרומטר. Over-confluence גורם הבחנה מושרה מגע ולהפחית את יכולת התא. השתמש בשיטה דיסוציאציה עדינה: Accutase הוא מתון יותר מאשר לנסות ולשמור סימני פני השטח.לאחר דיסוציאציה, תאים rese rese reseed ב צפיפות של 2 / 2 / 2 / 2 / ספירת תאים נמוך יותר.

Inhibitors of differentiation

כמה מולקולות קטנות יכולות לעזור לשמור על מצב מבשר כאשר משתמשים לצד גורמי צמיחה:

  • (ב) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • (ב) [15] ,9177 ,9172, LDN-193189): בשימוש בעיקר ב-IPSC בחדירה עצבית, אך ניתן להוסיף לקווים מסוימים של NSC.
  • (ב) [13] ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇

Hypoxia כגורם לזיכרון

כאמור, מתח חמצן נמוך (25% O2) מפעיל גורמים hypoxia-inducable (HIF-1α ו HIF-2α) כי מעלה גנים של גזע כגון Sox2 ו- Notch1. Hypoxia גם מפחית מינים חמצן תגובתיים (ROS), אשר אחרת יכול לגרום נזק לדנ"א ולגיל ההתבגרות.

בקרת איכות ואפיון

ניטור קבוע של תרבויות NSC מבטיח עקביות והתאמה מחדש.

  • (FLT:0 Morphological Check: FLT:1 בריא NSCs ב monolayer להראות דו קוטבי או רב קוטבי מורפולוגיה עם גופי תאים בשלב הנכון. Neurospheres צריך להיות עגול עם קצוות חלקה.
  • (FLT:0) ,Immunocytoכימיה: סטומב 1 (Stin for Nestin (בשר עצבי בוגר), Sox2 (נפיחות / עצבנות) ו-K-67 (תפוצה) תרבויות מעבר נמוך צריכות להיות > 90% תאים חיוביים של נסקין.
  • (FLT:0) cytometry:FLT:1 , Quantify מסמן פני השטח כגון CD133 (פרומיןן-1) ו- CD15 (SSEA-1). A Shift in Marker ביטוי אותות שונים.
  • (ב) ,0) ,Karyotyping: FLT:1show inסדיר המרווחים (למשל, כל 10 קטעים) כדי לזהות הפרעות כרומוזומליות שיכולות להתעורר באופן ספונטני.
  • (FLT:0) בדיקות של Mycoplasma: FLT:1 השתמש ערכות מבוסס PCR בכל חודש. זיהום Mycoplasma משנה באופן חמור את התנהגות התא ויכול ללכת ללא הפרעה.

בעיות נפוצות

נספח תאים

אם תאים מתפוגג בתוך 24 שעות, לאמת איכות ציפוי.בטיח פתרונות אש"ף ו- laminin הם טריים סטריליים.בדוק כי ה- pH של פתרון הציפוי מתאים (lamin עובד הכי טוב ב- pH 7.2-7.4). שקול באמצעות laminin recombinant נוטה לתת תוצאות עקביות יותר.

התרחבות נמוכה

צמיחה איטית יכולה לגרום לגורמי צמיחה מותשים - להוסיף EGF /bFGF טרי כל 2-3 ימים. לבדוק עבור Mycoplasma. אם תאים משמשים לחמצן נמוך, העברתם לתנאים סטנדרטיים עשויה להפחתת הצמיחה.

המונחים: differentiation

לעתים קרובות נראה כי תהליכים ארוכים, מעוכבים או קלומפס תאים שטוחים.צמצם את ההשפעה על ידי מעבר מוקדם יותר. Remove כל תוספי סרום או לא מוכר.אם באמצעות נוירוספירציות, להימנע לתת להם לגדול גדול מדי. חלק הקווים NSC דורשים תוספת של tch ligand D4 כדי לשמור על גזע; הוספת מאק לא פעיל.

זיהום

זיהום אווירי או פטרייתי הוא בדרך כלל ברור (מדיום ענן, ירידה ב- pH) כדי למנוע את זה, תמיד לסנן גורמי צמיחה באמצעות 0.22 מסננים מיקרומטר, להשתמש בטכניקות סטריליות, ולבודד את ה- incubator. for contamination עקשן, להוסיף אנטיביוטיקה באופןסלקטיבי אבל תרבות כמה מעברים במדיום ללא אנטיביוטיקה לאחר מכן כדי להבטיח קווים נקיים.

פרוטוקולים שונים (Brief Review)

(הדגש של מאמר זה הוא על שמירה על NSCs לא אדישים, חשוב לדעת כיצד לגרום להתאמה או יישומים (ForFLT:0neuronal differentiation forpLT:1, להסיר את EGF ו- bFGFGF) ולהוסיף נוירוטרופין שונה (BDNF) עם מומנטום בינוני (Flow-Fgicul-Fgicgic) ו-Fgicle-Fgicle-Fgation)

פרספקטיבה ויישומים עתידיים

ההתקדמות באופטימיזציה של התרבות מאפשרת מודלים מתקדמים יותר ופיזיולוגיים רלוונטיים NSC. השימוש בכימיקלים מוגדרים, תקשורת ללא xeno מפחיתה השפעות אצווה ותומכת בתרגום קליני.פלטפורמות מיקרו-השפעה מאפשרות כעת שליטה דינמית של חמצן ו ⁇ חומרים מזינים, חיקוי הנישה הנוירווסקולרית.

בנוסף, התרחבות בקנה מידה גדול ב bioreactors עם microcarriers פותחה עבור יישומים תעשייתיים.מערכות אלה דורשות ניטור זהיר של לחץ הירר והעברת גז, אך יכול לייצר מיליארדי NSCs למחקרי השתלה.ההנחיות של ה- FDA על מוצרי תאי גזע אנושי מדגישות את הצורך בתכונות איכות חזקות, מה שהופך את תנאי התרבות לתנאי רגולטוריים.

מסקנה

אופטימיזציה של תנאי תרבות עבור תאי גזע עצביים היא משימה רבת פנים הדורשת תשומת לב לכל פרט, מהבחירה של גורמי המדיום והצמיחה החמקמקים לשליטה במתח החמצן ונוקשות תת-קרקעית. על ידי שמירה על סביבות ללא לחץ המחקות את המוח המתפתח, החוקרים יכולים לשמר את NSC-התחדשות עצמית, גנומית ופוטנציאל של הבחנה.