כיצד להשתמש בטכניקות זרימה מעצורים כדי למדוד את התגובה המהירה Kinetics

האתגר של תגובה מהירה

רבים מהתהליכים הכימיים והביולוגיים החשובים ביותר מתרחשים על פני השטח של מילימטרים, מיקרו-שניות, או אפילו מהר יותר. אנזימים שיתוק, חלבון מתקפל, ligand מחייב, ו- אלקטרונים מעבירים הכל במצמץ של שיטות זיהוי מסורתיות, אשר מסתמכות על שילוב ידני או מזחלות, לא יכולים לפתור אירועים מהירים יותר מאשר שנייה אחת כדי לחקור את העולם של תגובה מהירה, אשר חדלו תערובת מהירה של זמן אחד, אשר חדלה, כאשר משתמשים בטכניקות זמן קצר, אשר חדלודות, כאשר הם כוללים שילוב של שיטות זמן אחד, כאשר הם כוללים, כאשר הם כוללים שילוב מהיר של שיטות זמן אחד, כאשר שיטות זמן קצר של שיטות זמן אחד, אשר מפסיקות, כאשר הם כוללים שילוב של שיטות זמן אחד, אשר מפסיקות במהירות גבוהה של שיטות זמן קצר של שיטות זמן אחד, כאשר הם כוללים, כאשר הם כוללים שילוב של שיטות זמן קצר של שיטות זמן אחד, כאשר הם כוללים שילוב של שיטות זמן קצר של שיטות זמן קצר של שיטות זמן קצר.

מהי טכניקת ה-Flow-Flow?

טכניקת זרימה של הפסקת-החל היא שיטה להשביע ולהתבונן בתגובות כימיות או ביוכימיות מהירות בתנאים מבוקרים. בצורתה הפשוטה ביותר, שני פתרונות מגיבים או יותר מונעים מזרקות נפרדות לתוך תא ערבוב, שבו הם מובאים יחד ומעורבות מלאה בתוך שבריר של שנייה של שפעת.הפתרון המעורב זורם לתוך תא תצפית, לעתים קרובות cuvette קטן, ואת זרימת הדם הוא בפתאומיות על ידי עצירה בפועל של תגובה גופנית או עצירה באופן מיידי, לאחר זמן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, הוא מגלה תגובה מעגלית, או ירידה של זמן קצר, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, הוא מגלה תגובה מעגלית, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, הוא מגלה תגובה מהירה של זמן קצר לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, הוא מגלה את ההתבוננות לאחור, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, הוא מגלה את

פותח במקור בשנות ה-40 והעודן במשך עשרות שנים, כלי זרימה של זרימה ממושכים, מופעלים באופן ידני במערכות ממוחשבות, בעלות על מחשבים, מכשירים רגישים מאוד המסוגלים לזהות רב-סגולי גלים.מכשירים מודרניים להשיג באופן שגרתי זמני מת (הזמן בין שילוב לבין תחילת רכישת נתונים) של אחד לשני מ"תות, וגרסאות מיקרו-השפעה מיוחדות יכולות לדחוף את הגבול הזה מתחת ל-100 שניות.

איך זה הפסיק לעבוד?

מחזור ההפעלה הליבה של מכשיר זרימה של הפסקת-זרימה יכול להישבר לכמה שלבים נפרדים:

פתרונות תגובה (FLT:0) ל-Loading:0 (FLT:1) נמצאים בשני סירינגים או יותר.סינגו אלה בדרך כלל מוסגרים כדי לשמור על טמפרטורה קבועה.
(FLT:0) נהיגה:03:1) מערכת כונן פוני או מכני דוחף את הסירינג צונח קדימה בו זמנית, מה שחייב את המשיבים דרך מהירות גבוהה לתוך תא ערבוב קטן.הכונן הוא בדרך כלל מהיר ויעיל, הבטחת שערי זרימה עקביים.
(FLT:0) Mixing:FLT:1 בתוך תא ערבוב, זרמי מגיבים מעורבים מאוד. Common Mixer Geometries כוללים T-jets, עיצובים ארבעה-ג'ט טנגנטיים, וכדור מתערבבים, כל אחד מהם מותאם כדי להשלים שילוב בתוך 100-500 מיקרו-שניות.
(FLT:0)Flow לתוך תא התצפית: FLT:1 הפתרון המעורב עובר דרך תא התצפית - uvette קטן עם חלונות אופטיים.
(FLT:0 stop and data Acquisition:FLT:1 כפי שהתערובת ממלאת את תא התצפית וכל נפח במורד הזרם, זה בסופו של דבר דוחף נגד הפסקת הסירינג. כאשר הפסקת הסירינג מגיעה למגבלה מוקדמת, מתג מפעיל שני אירועים: הזרם הופסק, ותיעוד נתונים מתחיל.
(FLT:0)Wash and Returnem: 1 לאחר איסוף נתונים, תא התצפית ותא ערבוב משוטים עם buffer או הדגימה הבאה, והמחזור חוזר על מדידות או תנאים שונים.

המונחים: a stop-Flow instrument

הבנת התפקיד של כל רכיב עוזר להעריך את הכוח והמגבלות של הטכניקה.

(FLT:0)Drive סינינגס ומבצע: ההרחבה צריכה לספק מהירות זרימה קבועה, התחדשות מחדש. pneumatic pistons הם נפוצים; מנועים שלב משמשים במערכות הדורשות בקרת נפח מדויקת.
(FLT:0) מ-Mixing Cell:FLT:1 היעילות של ערבוב קובעת את הזמן המת. מיקסרים באיכות גבוהה משתמשים בזרימה סוערת בערוצים קטנים כדי להשיג הומוגניות מהירה.פעמים מת נמדדות לעתים קרובות על ידי התבוננות בתגובה של תקן (למשל, ירידה של 2,6-dichlorophenolindool על ידי חומצה קוגניבית).
(FLT:0)Observation תא:FLT:1 בדרך כלל a quartz cuvette עם אורך נתיב של 1-10 מ"מ, המיועד לגישה אופטית מהירה.
מערכת תפוצה:0 (FLT:1 Photomultiplier צינורות (PMT) או ערכות photodiode משמשים לפקח על עוצמת האור. A monochromator או מסנן את אורך הגל המתאים. מכשירים מודרניים יכולים להקליט בו זמנית אורכי גל מרובים באמצעות מערךי דיוודה או מכשירים מכווננים (DCCs).
(FLT:0) לעצור סינינגה וטריגר: FLT:1 להפסיק סינינג מספק את ההגדרה של לחץ גב ופעולה כמו גורם מכני. חיישן אופטי או חשמלי מזהה את העצירה ומתחיל לרכוש נתונים עם עיכוב מינימלי.
(FLT:0) בקרת Temperature: 1FLT:1 הנתיב הנוזלי כולו - מעגילים, ערבוב ותא - הוא בדרך כלל סגור בלוק מכוס מים המחובר באמבטיה המפולגת כדי לשמור על טמפרטורה קבועה (לעתים קרובות 20-25 ° C, אבל יכול להיות מגוון).
מערכת רכישת נתונים:0 (FLT:1) ממירים אנלוגיים-לספרטיים במהירות מדגימים את אות הגלאי בשיעורים מקילומטרץ ועד מגהרץ, ולוכדים מאות או אלפי נקודות נתונים לשנייה.

תגובה מהירה Kinetics עם עצירות

מיצוי של Rate Constants from Transient Data

(ב) לאחר ש[[המאה ה-20]], [[המאה ה-20]], [[1966]], [[1924]]]], [[1924]]]]]], [[1924]]]]]]]], [[1924]]]]]], [[1924]]]]]]]]]], [[1924]]]]]]]]]]]], [[1924]]]]]]]]]]]]]]]], [[1924]]]]]]]]]], [[1924]]]]]]]]]]]]]], [[1924]]]]]], [[1924]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]], [[1966]]]]]], [[1924]]]]]]]], [[1966]], [[1966]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]]], [[1966]], [[1966]], [[1966]], [[1966]]]], [[1966]], [[1966]], [[1966]], [[1966]]]]]], [[1966]], [[1966]], [[1966]], [[1966]]]]]]]]]], [[1966]]]]]]]] [[[[1966]]]]]]

מנגנונים מורכבים יותר, כגון שתי שלבים מחייב או אנליזת אנזימים (Dais-Mentencins), דורשים התאמה גלובלית של מספר רב של עקבות שנאספו בתנאים שונים.חבילות תוכנה (למשל, KinTek, Biologic, או קוד פתוח כמו QtiPlot) משמשים כדי להתאים משוואות קצב משולב נגזר מהמנגנון המוצע.

פרמטר חשוב בניסויים בזרימת עצירה הוא זמן FLT:0deadture TimeFLT:1 [התגובה מהירה יותר מהזמן המת כבר התקדמה לפני נקודת הנתונים הראשונה נרשמת.זה אומר כי האמרה של השלב המהיר עשוי להיות מזלזל, שעלול להוביל שגיאות בניתוח הקינטי.

שיטות זיהוי

בחירת שיטת זיהוי תלויה בתגובה הנלמדת:

(FLT:0)UV-Visible סופגance: ⁇ F1 מתאים לתגובות הכרוכות בשינויים בריכוזים של כרומוזומופואר – למשל, תחלופה באנזימים או ברצועה מחייבת לשינויים בקליטת הקלטות.
(FLT:0) פלואורנס: 1FLT הרבה יותר רגיש מאשר סופגנות, אידיאלי לריכוזים נמוכים ולתגובות הכרוכות בשטף או בירופורפורפורפורפורוזיס (למשל, לנסות לפטופאן בחלבונים, דנסטל).
(ב) ופיזור רפוי אופטי (המילה): 0Circular dichroism (CD) ופיזור רוטטורי אופטי (ORD): אנדרט 1 משמש כדי לעקוב אחר שינויים במבנה משני, כגון קפיצת חלבון או התגלות.
(ב) פיזור אור:0) פיזור אור: 1 (FLT:1) שימושי עבור ניטור של אגרורגציה או פולימריזציה.
(ב) ⁇ :0) ⁇ אלקטרו-כימיקלית: 1FLT 1 פחות נפוץ אך אפשרי עם תאים מיוחדים הכוללים אלקטרודות.

יתרונות ומגבלות של הפסקת-פלו

יתרונות

(ב) רזולוציה גבוהה של זמן: 1FLT:1, פעמים מת של 1–2 מ"מ מאפשר התבוננות בתהליכים מהירים שלא ניתן לעקוב אחריהם באמצעות שילוב ידני.
(ב) ⁇ :0) ניטור בזמן אמת: 1FLT:1 עקבות רציף מספקים פרופילים קינטיים מלאים, לא רק מדידות קצה.
(FLT:0) צריכת דגימות מינימלית: 1FLT 1 כרכים אופייניים לניסוי הם 50-200 מיקרוL, וניתן לבצע מספר חזרות עלות עם כמויות קטנות.
(ב) ⁇ :0) ,Versatility: FLT:1 תואם מגוון רחב של מצבי זיהוי וסוגי דגימה - פתרונות, השעיה ואפילו כמה הכנות קרומיות.
(FLT:0) בקרת Temperature: FLT:1 ניתן למוסמכים את המערכת כולה, המאפשרת מחקרים על תלות בטמפרטורה וניתוח אררניניוס.

הגבלות

(FLT:0)Dead time Limiture: FLT:1 Responses מהר יותר מאשר - 1 ms לא ניתן לפתור לחלוטין; ההתפרצות הראשונית אבדה. עבור קינטיקה תת-מילי שנייה, טכניקות אחרות כגון פלאש photolysis או שיטות זרימה רצופות נדרשים.
(FLT:0) פריטים מ-Mixing: 1 מתוך שילוב שלם או לא צפוי יכול להוביל לעיוותים בסיס או אותות מעוררים.
(FLT:0) פריטים אופטיים:FLT:103) שינויים באינדקס השביר על ערבוב יכולים לגרום קפיצות בסיס, במיוחד כאשר ערבוב פתרונות של יצירות שונות.
(FLT:0) השפעות מושרה: FLT:1, כוחות הרהר גבוהים במהלך ערבוב עשויים להפריע כמה סטיות מקרומולקולריות עדין, למרות שזו לעתים רחוקות בעיה עבור חלבונים קטנים ואנזימים.
(FLT:0) מחויב לפתרון: ריצוף 1 (FLT:1) , אשר פתור הוא מיועד בעיקר לדגימות נוזליות; מצב מוצק או דגימות מולקווס מאוד מאתגר.

יישומים של מדע עצור-פלוס

Enzyme Kinetics and Mechanism

(ראהטרוסקופיה של זרימה) היא אבן הפינה של האנזימולוגיה מכניסטית.על ידי ערבוב אנזים עם היווצרות המוצר substrate ו ניטור או קליטת מוצר, החוקרים יכולים לקבוע קבועות של קצב טרום-מצבי שחשפו שלבים בודדים במחזור הקטליטי למשל, פרץ של היווצרות של המוצר במכלות הראשונים של תגובה יכול להצביע על מוצר מערכי קצב: 1FactiFactation Retenation Remotation Retenation Retenation Remotation Remotation to Reduction to Retenation 2.

חלבון מתפלע ולא מכפל

(המחקר של דינמיקת חלבון דורש יזום מהיר של התגובה המתקפלת.בניסוי טיפוסי של זרימה של זרימה של חלבון מתקפל, פתרון של חלבון מתפתח (למשל, ריכוז גבוה decornt) מעורב במהירות עם עודף גדול של חלבון buouted, גרימת שכפול מחדש של מחזורים של 3, 000) מ-Flowtrantrantrants, או extrinsic דיווחים על עקבות מבניים על פני כמה פעמים:

Ligand Binding and Drug Discovery

(הרחבת שיעורי ההתאגדות והדיוציאציה של סמים או ligands טבעיים ממטרותיהם היא קריטית ב- Pharmacology.- זרימה של זרימה מוגבלת יכול לפתור אירועים מחייבים המתרחשים על מדי פעם תת-שנית.הטכניקה מסייעת לקבוע אם מחייבת לעקוב אחר מנגנון דו-מולקולי פשוט או כרוך בצעד שינוי קונפורמטיבי (התאם המושרה) של מידע כזה עם אופטימיזציה של תרופות על פני ספקטרום אופטיקה וגילוי תרופות על גבי ספקטרום של ספקטרום גבוה של ספקטרום: ספקטרום של ספקטרום של ספקטרום של ספקטרום של ספקטרום של ספקטרום של ספקטרום של ספקטרום של ספקטרום של ספקטרום גבוה יותר: 1.

תגובות כימיות מהירות

בכימיה איורגנית ו- אוניבומטית, זרימה של חדלה משמשת כדי ללמוד העברה של אלקטרונים, החלפת ligand ומחזורי קטליטית.לדוגמה, הקינטיקה של חמצן המחייבת למתחמי מתכת מעבר היא לעתים קרובות מדי מהירה עבור שיטות קונבנציונליות. על ידי ערבוב מפלקס מתכת מופחת עם פתרון חד-פעמי בזרימה, היווצרות של אמצעי מתכת-חמצן שניתן לעקוב אחר מנגנון החמצן מוקדם של הדבקה.

שינויים תואמים ב-Bioology Macromolecules

מעבר לחלבון מתקפל, פונקציות ביולוגיות רבות כרוכות בשינויים קונפורציונאליים המופעלים על ידי ligand מחייב, שינוי pH או קפיצת טמפרטורה. זרימה מעצורים בשילוב עם dichroism מעגלית או FRET (Förster resonance Energy transfer) יכול לפתור את התנועות האלה.הכדאיות של זרימה של זרימה רציפה ל-RNA ו-DNA הודגמה הוכחה, במיוחד עבור boswitchesriwitches ו-meszy.

התקדמות טכנולוגית: Stop-Flow Technology

מיקרו-השפעה-Flow

השילוב של עקרונות זרימה של חדלות לתוך שבבים מיקרו-השפעה דחף פעמים מת מתחת 100 מיקרו-מיקרו-חומריים.במכשירים מיקרו-השפעהיים, תערובת laminar מועצמת על ידי הדבקה כאוטית באמצעות ערוץ גיאמטריה מיוחד.מערכות אלה לצרוך אפילו כרכים מדגם נמוך יותר (nanoliters) וניתן לקבע עבור בדיקות קינטיות בעלות גבוהה.

ביקורת גבוהה: Flow

כדי ללמוד את ההשפעה של לחץ על שיעורי התגובה והכרכים של הפעלה, מכשירים של זרימה רציפה מותאמים לפעול תחת לחץ הידרוטי גבוה (עד כמה מאות MPa) מערכות כאלה הם בלתי יקר להבנה של יציבות חלבונים ואת המנגנונים של תגובות אנזומטיות בתנאים קיצוניים שנמצאו בסביבות עמוקים הים או כורים תעשייתיים.

Cryo-Stopped-Flow

הטמפרטורה של טמפרטורות ה-U-zero (נקרא לעתים קרובות Cryo-stopped-flow) מאפשר לחוקרים להאט את התגובות המהירות מספיק כדי לזהות ביניים צי.על ידי שימוש ב- Cryosolvents (למשל, תערובת של מים עם dimethyl sulfoxide או methanol) והפעלה בטמפרטורות נמוכות כמו -40 מעלות צלזיוס, שיעורי התגובות רבות מופחתים על ידי סדרי גודל של גישה זו כבר בהצלחה מלכודות ביניים.

השוואה עם טכניקות קינטיות מהירות אחרות

זרימה מעצורים היא אחת מכמה שיטות ללימוד תגובות מהירות; לכל אחד יש כוחות משלו ומגבלותיו:

(FLT:0) זרימה רציפה:FLT:1, המשיבים זורמים דרך צינור ארוך ונתונים נמדדים במיקומים שונים לאורך הצינור, המקבילים לזמנים שונים לאחר ערבוב. זרימה רציפה מציעה פעמים קצרות מאוד (מיקרו-שניות) אבל צורכת כמויות גדולות של דגימות.
(FLT:0) Flash photolysis / לייזר photolysis:cioFLT:1 השתמש דופק לייזר קצר כדי לעורר תגובה (למשל, דיסוציאציה של תרכובת הכלובנית) הוא מספק פתרון זמן מעולה (picothers) אבל דורש גורם photolabile.-flow הוא כללי יותר עבור כל תגובה שניתן להתחיל על ידי ערבוב.
(FLT:0) Temperature-jump (T-jump): FLT:1 עלייה מהירה לייזר או עלייה בטמפרטורה הנגרמת כתוצאה משחרור (דרגות ננו השניות) מרגיעה את שיווי המשקל, והחזרה לאיזון היא מעקב.T-jump הוא מעולה ללימוד שינויים תואמים מהירים אך מוגבל במערכות עם תלות טמפרטורה תלולה של שיווי משקל, הוא גמיש יותר עבור תהליכים עצמאיים.
(FLT:0)Quenched-flow: FLT:1 לאחר ערבוב ועיכוב מוגדר, התגובה מוזנחת על ידי הוספת reagent חמור (למשל, חומצה) והמוצרים ניתחו באופן לא מקוון.

שיקולים מעשיים לקביעת ניסוי עוצר-פלו

שמירה על נתונים קינטיים אמינים ממכשיר זרימה מעצורים דורשת תשומת לב זהירה לתכנון ניסיוני:

(FLT:0) בחירת כוח buffer ו- ionic Power:03:1 Solutions צריך להיות מסונן ו degasd כדי למנוע בועות אוויר שיכולות לגרום לממצאים.
(FLT:0) קביעת זמן מת: FIRLT:1 תמיד למדוד את הזמן המת של המכשיר שלך תחת אותו תנאי זרימה כמו הניסוי שלך באמצעות תגובה סטנדרטית (למשל, תגובה בין DCPIP לבין ascorbate).
(FLT:0) ניסויים ב-Control:FLT:1 להפעיל שליטה "זרימה בלבד" (שילוב אותו פתרון עם עצמו) כדי לבדוק את יציבות הבסיס.
(FLT:0) Data Averaging: FLT:1 בדרך כלל 5-10 משוכפלות בממוצע כדי לשפר את אות-לכאורה.
(FLT:0) בקרת Temperature: FLT:1 לשמור על טמפרטורה יציבה לאורך כל.עבור תגובות רגישות לטמפרטורה, אפילו סחף 1 מעלות צלזיוס יכול לשנות את קבועות השיעור באופן משמעותי.

מסקנה

טכניקות זרימה עוצרות פיתחו את המחקר של קינטיקה תגובה מהירה, המאפשר לחוקרים להתבונן בתהליכים שפעם היו חבויים מעבר למחסום השניות.מתובנות בסיסיות למנגנוני אנזים וחלבון מתקפלים ליישומים מעשיים בגילוי תרופות וחומרים, זרימת הזמן שנותרה כלי חיוני בארסנל של המדען והביוכימאי, בעוד כלי ממשיך להתקדם - עם מיקרו-קלידי, בלחץ גבוה, ומולקולות מפסיקות לגילוי נגישות של תהליכים מתקדמים, רק כדי לפתח את הדינמיקה של מערכות בקרה עוצמתיות.

(ב) לקריאה נוספת על יסודות הקינטיקה של זרימה, ראה את הטקסט הקלאסי של פרשט, (FLT:0Structure and Mechanism inחלבון SciencecioFLT:1, או את מאמר הביקורת על ידי Fersht:2) "עצורים-Flow Fluorescence Spectroscopy" בחשבונות של מחקר כימי: LT פרטים טכניים נוספים על עיצוב כלי ניתן למצוא על דפי LT5FD.