מדריך מקיף לטכניקות של Chromatography של ⁇ עבור ניתוח תרופות

מבוא ל- Thin-Layer Chromatography in Pharmaceuticals

chromatography של שכבות דק-שכבתית (TLC) נשאר אחד הטכניקות chromatographic הנפוצות ביותר במעבדות פרמצבטיות ברחבי העולם.פשטות, עלות נמוכה, וסיבוב מהיר להפוך אותו הכרחי לניתוח שגרתי, במיוחד בהגדרות בקרת איכות ופיתוח שיטות.במדריך מקיף זה, אנו חוקרים את הטכניקות, עקרונות, יישומים מעשיים של TLC לניתוח תרופות, מתן תובנות מעשיות עבור אנליסטים וחוקרים מחפשים זיהוי אמין וזיהוי תרופות.

TLC התפתח באופן משמעותי מימיו המוקדמים של המאה ה-20.היום, הוא נתמך על ידי גרסאות ביצועים גבוהים (HPTLC), סורקי דנסיטומטרי, ומניפסטים מדגם אוטומטי שמביאים נוקשות כמותית למה שהיה באופן מסורתי שיטה איכותית.עבור ניתוח תרופות, TLC משמש ככלי סינון חזק, טכניקת אישור לשיטות מקבילות, ואמצעי סינתטי מהיר לנטראקטיביות ולפיתוח.

עקרונות יסוד של TLC

בליבה, TLC מסתמכת על הגירה שונה של תרכובות בין שלב נייח לבין שלב נייד. שכבה דקה של מודעות אובנט - ג'ל סיליקה, או צלולוז - נקבעת על תמיכה שטוחה כגון זכוכית, שלב מתכת, או אלומיניום.הדגימה מוחלת קרוב לקצה התחתון של הצלחת, אשר ממוקם בחדר סגור המכיל שכבה רדודה של פתרון תנועה איטית יותר (כלומר, לחץ על תרכובות מהירות יותר) של תרכובות מהירות יותר של לחץ על גבי תחנת הפעלה (למשל, לחץ על גבי האינטראקציות סלולרי).

גורם השימור, או (FLT:0) הערך של ההרחבה 1 (Rf Value FIRFIR) מוגדר כיחס המרחק שנוסע על ידי המתחם אל המרחק שנוסע על ידי החזית המרשימה הזאת, כמות חסרת מימד זה אופיינית לתרכובת בתנאים קבועים של שלב נייח, שלב נייד, טמפרטורה ולחות.ערכי Rfable Reducible חיוניים לזיהוי, למרות שהם לא מוחלטים - אוריאציות ניסיוניות בפרמטרים יכולים לפעול על אותם סטנדרטיים.

שלב התחנה והנייד

שלב התחנה

ג'ל סיליק (Slica Gel 60 F254 הוא הנפוץ ביותר) הוא סוס העבודה של רגיל-phase TLC.זה הוא קוטב, מודעות חומציות אידיאלי עבור הפרדה בינוני הקוטב תרכובות הקוטביות כגון אלקלואידים, הידרואידים flavoids, ורוב החומרים הפעילים פרמצבטיים. Alumina הוא שלב אחר, המשמש לעתים קרובות עבור תרכובות שאינן יציבות על גבי סיליקה או דורשות שונות, כגון Cubofoic.

לוחיות מיוחדות כוללות אלה המוחזקים עם אינדיקטור פלואורסנט (F254) עבור ויזואליזציה של UV, או עם סוכני chelating לניתוח ion מתכת.הבחירה של שלב נייח מכתיבת את הקוטביות של השלב הנייד והשפעות ישירות עלסלקטיביות.

שלב נייד

בחירת שלב נייד היא הצעד הקריטי ביותר בפיתוח שיטת TLC.עבור רגיל-phase TLC, מערכת פותר הוא בדרך כלל תערובת של קוטבי נמוך (למשל, hexane, toluene) עם מנטרקט יותר (למשל, ethyl acetate, methanol, או glacial acetic חומצה).

אסטרטגיות שלב ניידות נפוצות כוללות שימוש בתערובת ternary (למשל, טולולן: אתיל אצט: חומצה אגטית) לקבלת פתרון משופר של תערובות מורכבות. גישות שיטתיות כגון מודל "PRISMA" או עיצוב ניסיוני סטטיסטי יכול לייעל את ההרכב ביעילות.החדר צריך להיות רווי עם אדנים מנוסים לפני פיתוח כדי למנוע אפקטים קצה ולהבטיח ערכים עקביים.

Instrument and Materials for TLC

לוחות ו Sorbents

לוחות TLC מסחריים מראש זמינים בגדלים שונים (בדרך כלל 20 × 20 ס"מ, 10 × 10 ס"מ, או 10 × 20 ס"מ) ועוביים sorbentes (0.2-0.25 מ"מ עבור תקן TLC, 0.1-0.2 מ"מ עבור HPTLC) בניתוח תרופות, HPTLC עם גודל חלקיקים קטן יותר (5-6 מיקרומטר) לספק פתרון טוב יותר וגילוי, קרוב ל-2 מ"מ"מ ל-LC יכול להיות גבוה יותר עבור יישומים גדולים יותר.

חדרי פיתוח

תא TLC צריך להיות חתומה חזק מספיק כדי להתאים את הצלחת מבלי לגעת בפתור או הקירות. Linear פיתוח (כמתקפה) הוא סטנדרטי.עבור לוחיות לאחור-phase, התא הוא לעתים קרובות רווי עם בשלב נייד vapors על ידי ריצוף הקירות עם נייר. Twin-troughs לאפשר פיתוח סימולטי של שתי צלחות בצד.

המונחים: Densitometry

הוראות איתור עם צינור micropipette או capillary עדיין נפוץ, אבל applicators אוטומטי (למשל, Camag Linomat או ATS) מאוד לשפר דיוק עבור עבודה כמותית.הדגם הוא מיושם כמו להקה צרה (בדרך כלל 6-10 מ"מ אורך) ולא מקום לשיפור הפרדה.לאחר התפתחות, כתמים יכול להיות ויזואלי תחת אור UV (nm או n66m), באמצעות aplin ספציפי, כגון נוגדנים או חומצה ספציפית.

לניתוח כמותי, מדרסמטר לסרוק את הצלחת באורכי גל ספציפי, מדידה של קולטנות או עוצמת פלואורסנס המתמדת באופן ליניארי עם ריכוז על טווח מוגבל. סורקי TLC מודרניים בשילוב עם תוכנה ייעודית מאפשרים ריצוף, אינטגרציה אזורית שיא ודיווח של תוצאות עם דיוק דומה ל-HPLC עבור יישומים חיצוניים רבים.

פיתוח שיטות ואופטימיזציה

פיתוח שיטת TLC חזקה כרוך בדיקות שיטתיות של שלב נייח, הרכב שלב נייד, עומס דגימות ומצבי פיתוח.התחל עם מערכת גנרית-פאזה (למשל, ג'ל סיליק 60 F254 עם אצט: תערובת אתית: hexane מזהה תערובת) ולהתאים את קוטביות.אם החלטה היא עניה, נסה מאמת כמו חומצה אצטית (עבורת) או תרכובות חלקית), אך יש לזהות את תרכובות בסיסית (Pgic) אבל יש עדיין אנליסטים (לדוגמה, אך ורק את האנליטית).

פרמטרים אופטימיזציה מרכזיים:

(ב) ,0) ,Ulvent PowerFLT:1: הגדלת שיעור המפלט הקוטבי מפחית את השימור (החלים Rf) לשלב רגיל.
(ב) [ה]: שינוי האופי הכימי של השלב הנייד (למשל, מ-אתיל אצטיטה לאסון או tetrahydrofuran) יכול לשנות את סדר ההפרדה.
(ב) ⁇ :0) ⁇ (ב) , (ב) , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
(FLT:0) Temperature and לחותFLT:1: הטמפרטורה של שליטה ל- ± 2C ולחות יחסית מתחת ל -60% עבור יעילות טובה ביותר של חנויות בפלקטור.
(ב) ⁇ (ב) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇

שיטה טובה-אופטימית צריכה להניב אזורים סימטריים, משונים היטב עם זנב מינימלי.מבחן התאמת המערכת דורש לעתים קרובות כי ההחלטה בין שיאים סמוכים היא לפחות 1.5, ואת Rf של מתחם היעד נופל בתוך ±0.05 של תקן.

ניתוח Qualitative ו- Quantitative Analysis

זיהוי סודיות

בניתוח תרופות, TLC משמש לעתים קרובות לבדיקת זהות של חומרים גלם ומוצרים מוגמרים.האנליסט משווה ערך Rf וצבע נקודה (תחת UV או לאחר derivatization) של דגימת הניסוי עם זה של תקן התייחסות לרוץ על אותה צלחת.טכניקה זו רשמית ברבים copendia: לדוגמה, US Pharmacopeia (USP) כולל בדיקות זיהוי עבור רבים APIs ו-Aphient עבור בדיקות ALTUS.

ניתוח טכני על ידי Densitometry

Quantitative TLC (הנקרא לעתים קרובות HPTLC) כולל סריקה של הצלחת עם מדמונים כדי ליצור chromatogram.המכשיר מודד את כמות האור נספג או נפלט על ידי האזורים נפרדים. עבור קוונטיזציה מדויקת, הצלחת הוא לסרוק בקליטת מקסימלי של ה- אנאליט, או לאחר פיזור של reagent derivatization המייצרת chromorephore בדרך כלל מטווח סטנדרטי.

פרמטרים אימות עבור TLC כמותית כוללים מפרט, לינאריות, דיוק (דיוק בינוני), דיוק, הגבלת גילוי (LOD), והגבלת הקוונטיות (LOQ) על פי הנחיות ICH, LOD ו- LOQ עבור שיטה נתונה צריך להיות נקבע מ עקומת calibration.הדיוק של תחמוצת שיניים (coefficient of Varitation,V%) מקובל על 5% עבור יישומים פרמצבטיים.

שולחן של תנאים טיפוסיים של דנסטומטרי עשוי להיראות כך (ב-HTML, אנו יכולים להשתמש ב-FLT:0), אך ההוראה לא תאפשר במפורש שולחנות; עם זאת, טבלאות הן בסדר ב- HTML.

**Typical Densitometric Parameters for HPTLC Quantitative Analysis**
Parameter	Setting
Wavelength	254 nm (absorption) or 366 nm (fluorescence)
Slit dimensions	4 mm × 0.3 mm
Scanning speed	20 mm/s
Data resolution	100 µm
Calibration mode	Linear regression or polynomial (second order)

יישומים בניתוח תרופות

בדיקות זהות וטוהר

TLC היא השיטה הראשונה של אימות זהות של API או מרגש. רוקפואס רבים לציין בדיקות TLC הדורשות השוואה של Rf והופעת נקודה עם תקן. עבור הערכת טוהר, TLC יכול לזהות חומרים קשורים ומוצרים השפלה ברמות למטה ל-0.1% כאשר בשילוב עם משככי זיהוי סלקטיבית.לדוגמה, בדיקת טוהר על ידי TLC משתמשת אחליקה עם רוחב 4 מולקולה: סגסוגת של חומצה סלולריתמיית עם סגסוגת עם סגסוגת 4.

לימודי יכולת והערכה

מחקרים של השפלה כפויה (בדיקת מתח) בתנאים של חום, אור, לחות, וחמצן לייצר מוצרים דליקים כי יש להפריד מן התרופה ההורה. TLC משמש לעתים קרובות כטכניקה מהירה סקאוט לפני הרחיבה את פיתוח שיטת HPLC.היכולת להפעיל דגימות מרובות במקביל על צלחת אחת עושה TLC יעיל עבור הסתברות המציין אסימונים שבו נקודות זמן רבות נבדק.

מעקב אחרי Synthesis

במהלך סינתזה לסמים, TLC היא השיטה המועדפת על התקדמות התגובה. aliquot קטנה של תערובת התגובה ניתן לסגת, הבחין על צלחת TLC, ופותח בתוך דקות.הופעת כתמים המוצר וההעלמות של החל כתמים חומריים החל מדריכים את הכימאי בקביעת השלמות התגובה. משוב אמיתי זה הוא בלתי חוקי בתהליך בקנה מידה ואופטימיזציה.

ניתוח סמים צמחי וזיהוי נגד

טביעות אצבע TLC משמשות רבות לאימות של תרופות צמחיות וגילוי של מבוגרים. סדרה אופיינית של כתמים מתחת ל-UV ולאחר מניעת הפליטה מספקת זיהוי בוטני כי הוא פשוט לתעד ולהשוות. בדומה, TLC יכול לזהות במהירות מוצרי תרופות מזויפות: היעדר ה- API הצפוי או נוכחות של מקומות נוספים מרמזת על tampering.The World Health Organization (WHO) ו- International Pharmacoepoeia כוללים שיטות לסינון סטנדרטיות עבור חומרים אלה באמצעות שימוש ב-FLC רפואי.

יתרונות ומגבלות

יתרונות

(FLT:0)Low CostFLT:1: צריכת מינימלית (10-50 מ"ל לריצה) וחומרים זולים בהשוואה לעמודות HPLC ולמשאבות.
(ב) התפתחות טיפוסית של TLC לוקח 15-60 דקות; דגימות מרובות ניתן להפעיל בו זמנית על צלחת אחת.
(ב) [15] ,[[1924]]]]]]: [[1924]]]]]]]], [[1924]]]]]]]], [[1924]]]]]], [[1924]]]]]]]]]]
(ב) ניתן להפעיל ניתוח של × 20 ס"מ: עד 20 או יותר דגימות ניתן להפעיל על לוח 20 × 20 ס"מ אחד, שיפור באמצעות חישוב.
(FLT:0) שיאיוול ראט'ל:1: ניתן לאחסן את הצלחת מפותחת כתיעוד קבוע של הניתוח, שימושי עבור תיעוד וביקורת.

הגבלות

(FLT:0)Lower resolutionveFLT:1: TLC בדרך כלל מספק צלחות תיאורטיות נמוכות יותר (כמה אלפים) בהשוואה ל-HPLC (עשרות אלפים), הגבלת היכולת להפריד תערובת מורכבות עם רכיבים רבים.
(FLT:0)Quantitative דיוקFLT:1: ניקוד ידני ופיתוח פנויות יכול להציג שגיאות.מערכות אוטומטיות לשפר דיוק, אך להגדיל את העלות.
(FLT:0) הגבלות ענישה (FLT:1): גם עם דנסימטריה, גבולות זיהוי הם בדרך כלל גבוה יותר (טווח מיקרוג) מאשר HPLC או LC-MS (טווחng) לניתוח של עקבות, TLC אינו אידיאלי.
(FLT:0) דינמיקה ליניארית טווח דינמיות לינארית טווח 1FLT: מערכת היחסים ספיגה היא ליניארית רק על שני פקודות של גודל, הדורשות מספר רב של דגימות עבור הקוונטים.
(ב) ⁇ :0 (Operatorתלוי בחזקות) 1:1: יעילות מסתמכת במידה רבה על טכניקה עקבית - גודל נקודה, מיקום, תנאי תאים ותזמון התפתחות.

השוואה עם טכניקות Chromatographic אחרות

TLC לעומת HPLC

ביצועים גבוהים של chromatography נוזלי (HPLC) מציעה פתרון מעולה, רגישות ואוטומציה לניתוח כמותי שגרתי.עם זאת, TLC הוא מהיר יותר עבור שיטת סריקה ראשונית, דורש פחות מפתור, ומאפשר ניתוח מדגם במקביל.עבור בקרת איכות תרופות שבו בדיקת זהות מהירה מספיק, TLC הוא לעתים קרובות מועד מועדף. עבור אסימונים כמותיים עם דרישות רגולטוריות קפדניות, HPLC הוא בדרך כלל חובה.

TLC לעומת Gas Chromatography (GC)

GC מוגבל תרכובות יציבה ותנודתיות תרמית; TLC יכול להתמודד עם חומרים לא-וולגנטיים, thermolabile, וקוטב ללא תחרות. לדוגמה, TLC הוא המועדף על ניתוח אנטיביוטיקה רבים, סטרואידים, תמצית צמחית כי להיפטר ב- GC injector. Converse, GC מציעה פתרון גבוה מאוד עבור תערובת תנודתיות משולב עם מסיבית עבור סימפטומטיות עבור זיהוי סופי.

מסקנה

chromatography של אנליסט טק-שכבתית נשאר כלי חיוני בתיבת הכלים של אנליסט התרופות.זה מספק אמצעי מהיר ויעיל לזיהוי מורכב, הערכה טוהר, ניטור ובדיקת יציבות, בעוד שהוא לא יכול להחליף HPLC או GC עבור עבודה כמותית ברזולוציה גבוהה, הפשטות שלה והפך להבטיח את השימוש המתמשך שלה הן בסביבות מחקר והן בקרת איכות.