שמירה על סטריליות במעבדות תרבות התא היא יסודית ליעילות ולת תוקף של תוצאות ניסיוניות.אירועים של זיהום, בין אם חיידקי, פטריות, מטבולית, או חוצה-תא, יכול לפסול שבועות או חודשים של עבודה, לבזבז ריבים יקרים, ופשרות שלמות נתונים.קצב זיהום של 5–10% יכול אפילו לגרום לתוצאות עצומות באופן דרמטי, מה שהופך את המסגרת לבלתי אפשרית לאפקטים של מערכת בקרה זו לחשיפה של סרטן, הוא קריטי, לא הוכחה, לא הוכחה, ולכן הוא קריטי, לא הוכחה מדעית, לא הוכחה ברורה, ולכן, הוא קריטי, לא ניתן לשמר את כל הוכחה מדעית, כלומר, כלומר, לא פחות מאפקטים, הוא קריטי, כלומר, לא פחות מאפקטים, לא פחות מאפקטים, שמירה על בסיס של תרבות מבוססת על בסיס אופציונלית.

מקורות של זיהום בתרבות התא

הבנה היכן מקורם של contaminants היא הצעד הראשון למניעת הריון.המקורות העיקריים נופלים לקטגוריות אחדות:

Personnel

(ה) בני האדם הם הווקטור הנפוץ ביותר של תפלת עור, טיפות נשימה, ושופכת שיער יכול לשאת חיידקים ופטריות לתוך אזור העבודה, אפילו מגע אהוב יחיד על מכסה כלי תרבות יכול להציג את ה-FLT:0StaphylococcusFLT:1 או FLT:2pergillusLTF3ores;

איכות הסביבה והאיכות האוויר

אוויר מעבדה מכיל חלקיקים מושעה, כולל ספירות מיקרוביאליות (Cubal spores) עבודת תרבות התא חייב להתבצע בתוך ארון מוסמך (FLT:0) Class II BioSafety הקבינט (BSC) , כולל אוויר מלוטש HEPA.עם זאת, אפילו BSC יכול להיות נפגע אם הטיפול האוויר של החדר הוא לא מספיק או אם הקבינט ממוקם ליד דלתות, vents, או אזורים באיכות גבוהה, כולל אחסון במים, וכן על קירות סביבתיים אחרים.

סליחות ו-Reagents

תרבות מדיה, סגלגל, טריפסין, אנטיביוטיקה יכול להיות מזוהם במהלך הייצור, אחסון או טיפול.למרות תקשורת מסחרית הם אחסון מטומטמת, לא תקין - כגון להשאיר בקבוקים ללא מעצורים או שימוש בהם לפני התפוגה - יכול לאפשר צמיחה מיקרוביאלית.FLT:0Fungal spores בסרוםFLT:1 הם גורם ידוע לשמצה של אובדן מים.

קווי תאים לעתים רחוקות

ניתן גם להציג את קו התא. Mycoplasma הוא המדבק ביותר כי זה לא לייצר זעזועים גלויים או שינוי pH.מחקרים מעריכים כי FLT:015-35% מתרבויות התא בשימוש נפוץ הם Mycoplasma- PositiveFLT:1, לעתים קרובות ללא הידע של החוקר.

(FLT:0) "הזיהום של Mycoplasma יכול לשנות כמעט כל פרמטר סלולרי למד, כולל ביטוי גנים, חילוף החומרים ותגובה לסמים.בדיקת כל קו תאים נכנס ולאחר מכן חיוני."

תרגולים מרכזיים לשמירה על יציבות

עבודה בקבינט מוסמך ביו-בטיחות (BSC)

BSC הוא אחד הציוד החשוב ביותר עבור תרבות תאים סטרילית.הוא מספק זרימת אוויר חד-צדדית, HEPA-filtered כי מגן הן המפעיל והן על התרבויות.עבור עבודת תרבות התא, AFLT:0Class II, Type A2FIRFLT:1 הוא סטנדרטי.

  • (FLT:0) אישור ותחזוקה: FLT:1 יש BSC מוסמך מדי שנה (או יותר לעתים קרובות) על ידי טכנאי מוסמך. לבדוק את אזעקה זרימת האוויר ואת שלמות מסנן HEPA.
  • (FLT:0) השימוש ב-Proper: ⁇ FLT:1 שמור את ה- sash בגובה הנכון. להימנע מחסימת חזית או אחורית של גרילה.מקם את כל הפריטים בתוך הקבינט לפני תחילת העבודה - על זרימת האוויר, למנוע תנועות זרוע מהירות שעלולות לשבש את שדה סטרילי.
  • (FLT:0) להורדת וטעון: דיסינפול 1 (בקבוקים בינוניים, טיפים טמאטים, צפי צינורות) עם 70% אתנול לפני הנחתם לתוך חומרי BSC. Arrange כך שתחומים נקיים (בקבוקים בינוניים) מופרדים מפסולת (מקטרות בשימוש).
  • אור ה-FLT:0 (Ultraviolet): אור ארונות רבים יש אור UV עבור פירוק בין שימושים. השתמש בו לפחות 15 דקות לאחר העבודה, אך שימו לב כי UV אינו תחליף לחיטוי פני השטח עם אתנול.

ציוד הגנה אישי והיגיינה

אפילו עם BSC, הידיים של המפעיל הן מקור זיהום ראשוני.(FLT:0Wash Hands ביסודיות FLT:1 עם סבון אנטימיקרוביאלי לפני הכניסה לאזור התרבות התא.לבוש ניטילר ללא אבקה או כפפות לטקס שמתאימות היטב.לאחר נטילת כפפות, ריסס אותם עם 70% אתנול ולאפשר להם אוויר-ד; חוזר על התקופה.

  • (ב) ⁇ :0)אהבה משתנה: 1 שינוי כפפות מיד אם הם נוגעים בכל דבר שאינו סטרילי – מחוץ לבקבוק תקשורת, שביתת הזרוע של כיסא, דלתק, או הפנים שלך.
  • (ב) ,0) במעילי:0.18Lab: ללבוש מעיל מעבדה ייעודי המשמש רק בחבילת התרבות התאית.
  • (FLT:0) מסכות וכיסויי שיער: FIRLT:1; מסכה כירורגית מפחיתה לשפוך טיפות, וכובע שיער או כובע מלוטש מונע שיער רופף ליפול לתוך תרבויות.עבור עבודה של שקיפות גבוהה (למשל, תאים ראשוניים או תאים לשימוש קליני), מגן מלא יכול להיות מתאים.

ציוד סטרילי ו- Supplies

כל פריט שמגיע במגע עם תרבויות או מדיה חייב להיות סטרילי.זה כולל צינורות, טיפים צינורות צינורות (עם מסננים), צפים, צינורות צנטריפוגה, ו Cryovials. השתמש רק FLT:0certified sterileFLT:1 פלסטיק; להימנע משימוש פריטים חד פעמי.

  • (FLT:0Media ותוספים:FLT:1 Sterilize מרכיבים רגישים חום (למשל, אנטיביוטיקה, ויטמינים, גורמי צמיחה) על ידי סינון דרך מסנן 0.22 ⁇ m.
  • (ב) ויקרא:0) ויקרא: "בְּלֹאֶתְלֹאֶת, אִם נָאֶת הָאָרֶץ אֲשֶׁר נָתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִיתִית, וְהָבְתוֹכִיתִיתִיתוֹ" (ב"ב"ב"ב"ב, כ"ב).
  • (FLT:0) ניהול חומרים:FLT:1ir ⁇ ⁇ באופן קבוע - לשפשף מדפים ומחבתות מים עם חיטוי (למשל, 70% אתנול או תרכובת אמניום חד-משמעית) השתמש במים סטריליים, ללא נחושת במחבת לחידוד צמיחה חיידקית.

מיני תרבות פתוחה

בכל רגע שבו כלי תרבות פתוח, הוא פגיע.FLT:0Plan your workflowFLT:1 כך שתוכל לבצע את כל מניפולציה במהירות וביעילות. השתמש בטכניקה ספקית: להחזיק כובעים באופן סטרילי (לא להגדיר אותם על פני השטח BSC), להבות של בקבוקי זכוכית (אם משתמשים זכוכית), ולהשתמש במהירות, חלקה בעת פתיחת וסגירה.

  • (ב) ⁇ :0) עבודה במזווה: 1 בינואר, כאשר עיבוד תרבויות מרובות, הדהים את העבודה שלך כך שאתה אף פעם לא מדביק כמה סדקים פתוחים.
  • (ב) ,0) ,Pipetting: 1FLT ( 1:1) השתמש בצנרת סטרילית נפרדת לכל העברה נוזלית.
  • (FLT:0) השימוש באנטיביוטיקה: 1FLT) בעוד ש-Picillin-streptomycin או gentamicin יכול לדכא כמה ממזהמים חיידקיים, הם לא הורגים את Mycoplasma או פטריות. over-reliance על אנטיביוטיקה יכול גם להסתיר זיהום ברמה נמוכה.

עבודה על פני השטח והציוד

לפני ואחרי כל מפגש עבודה, לנקות את כל פני השטח בתוך BSC עם חיטוי.070% אתנולרטוFLT:1 הוא הבחירה הנפוצה ביותר כי הוא מתאדה במהירות והוא יעיל נגד חיידקים רבים וירוסים. עם זאת, זה לא להרוג את כל אורגניזמים בעלי ערך ספירה; עבור ניתוק עמוק יותר, לסובב עם חיטוי חיטוי חיטוי חיטוי (gfrefreative) לאחר מכן, 10% מים.

  • (ב) ⁇ :0) ניקוי עמוק: 1FLT 1אנדרטה לפחות פעם בשבוע, להסיר את כל הפריטים מ- BSC לנקות את הפנים ביסודיות עם ניקוי עצום, ולאחר מכן עם 70% אתנול, תן לקבינט לרוץ לפחות 10 דקות לאחר מכן כדי לטהר כל אדינים.
  • (FLT:0Outside the BSC:FLT:1 Disinfect ספסל העליון, incubator מטפל, מיקרוסקופ עיניים, ומקלדת מחשבים באופן קבוע.

הרחבת הפרקטיקה הטובה ביותר עבור Long-Term Sterility

עיצוב מעבדה וזרימת עבודה

הפריסה הפיזית של המעבדה לתרבות התא יכולה לעזור או לעכב סטריליות.באופן אידיאלי, המעבדה צריכה להיות אזור ייעודי "נקי" נפרד ממיקרוביולוגיה כללית או חללי ביולוגיה מולקולרית.FLT:0Positive Air Pressure Pressure (FLT:1 בחדר התרבות התא (יחס למסדרון) כוחות אוויר בחוץ, מניעת כניסה של אוויר לא מלוטש.

  • (הופנה מהדף "החלל":0) ,0 (Room Traffic: 1) הגבלת הגישה לאנשי מקצוע מיומנים בלבד, אל תשתמשו בחדר התרבות התא כשטח הליכה או אחסון. Post סימן חיצוני: "מעבדת התרבות של קלל - אל תיכנסו רק אם יש לכם שרביט קר או טרי".
  • (FLT:0) זרמים נקיים ומלוכלכים: קיד 1 (בהתאמה: 1) באופן אידיאלי, צריך להיות "מסדרון נקי" לכניסה (השלמה, אחסון של אספקת סטריליים) ותוואי נפרד להסרת פסולת.למרות שזה מותרות במתקנים רבים, פשוט עיצוב ספסל נקי וספסל מנקה בתוך המעבדה יכול לעזור.

מעקב ובדיקה לזיהום

ניטור Routine הוא חיוני, גם כאשר אין זיהום גלוי לעין הוא ברור.מעבדות התרבות התא צריך להיות תוכנית ניטור זיהום הכולל:

  • (FLT:0) בדיקות של Mycoplasma:FLT:1 השתמש בשיטות מבוססות PCR או תרבות עבור זיהוי Mycoplasma. לבדוק את כל קווי התאים החדשים עם קבלה, ומבחן הקימה תרבויות חודשיות.
  • (FLT:0)Bacterial and fungalהקרנה: FIRLT:1 , inoculate aliquot קטנה של סופר-אנטר תרבות (או ביל בינוני) לתוך מרק סויה טריפי ו- thioglycollate בינוני.comubate at 30-37 מעלות צלזיוס במשך 14 ימים; לבדוק באופן ויזואלי עבור זעזועים.
  • (FLT:0)Surface sampling:FreaLT:1 ; Swab BSC משטחים, פנים incubator וספסל העליון עם צמר כותנה סטרילי, ולאחר מכן מכווץ על צלחות של דם. Incubate וספיר יחידות קולוניה כדי לפקח על יעילות משטר ניקוי שלך.
  • בדיקה איכותית:0 (FLT) 1 (FLT) שימוש בלוחות (כלי טיס פתוחים עם גרגר) נותרו בתוך BSC ובחדר למשך 1-4 שעות.

חשדנות

למרות המאמצים הטובים ביותר, הזיהום עדיין יכול להתרחש במהירות:

  1. (ב) ⁇ :0) ⁇ את הספינה: "ה'" (ב"ג) "העביר את התרבות המזוהמת לאזור קוורצנטי הרחק מתרבויות אחרות.
  2. (ב) עיין במורמוסולוגיה באמצעות מיקרוסקופיה (בקטריה עשויה להיות מוטות או cocci; פטריות להראות hyphae) לבצע מכת דקדוק אם יש צורך.
  3. (FLT:0) בעת שמירת המשכורת (אם קריטי): קיד 1 (עבור Mycoplasma), השתמש במשטר חיסול מאומת (למשל, טיפול עם BM-Cyclin או Plasmocin) עבור חיידקים או פטריות, decontamination הוא לעתים רחוקות מוצלח; בדרך כלל בטוח יותר לפירוק התרבות ולקבל טריוויאלי מהמלאי המקורי.
  4. (ב) ,0) ,הכרת ה- BSC והציוד: ⁇ 1 (ה) השתמש בדלפק או בלחיצת פיסת עץ, ובמטען, ובכל פריט שעשוי להיחשף.
  5. (ב) ,0) ביצוע האירוע: FLT:1המחשה מה קרה, המקור הסביר, ופעולות תיקון שבוצעו.

אימון ותרבות של Asepsis

הציוד היקר ביותר במעבדת התרבות התאית הוא חסר תועלת אם הטכניקה של המפעילה היא עניה.

  • (FLT:0Drills and ביקורת: FLT:1 Conducts מדי פעם טכניקה אסימפטטית ביקורת - למשל, יש צופה טכנולוגי מנוסה שעון רכבת וציון כל צעד (שטיפת יד, טעינה BSC, צינורות, כלי סגירה).
  • [ה]מקרא: [ה] [ה] [ה]] [ה]]] [ה]]] [ה'] [ה'] [ה']'[ה]']'[ה']']'[ה']'[ה']'[ה']''''''''''''''''']''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
  • (FLT:0) מדריך ספר פתוח: 1FLT:1 Post כרטיס הקצוץ מהיר בתוך אזור BSC המסכם את השלבים העיקריים: לשטוף ידיים, תרסיס, חומרי עומס, כלי פתוח, העברה, כלי קרוב, להסיר, נקי.

שיקולים מיוחדים עבור תאים ראשוניים ותאים Stem

תאים ראשוניים (למשל, פיברסטוסטים אנושיים, hepatocytes) ו תאי גזע בולטים (iPSCs) הם בדרך כלל רגישים יותר ודורשים אפילו סטריליות קפדנית יותר.הם נגזרים לעתים קרובות מדגימות רקמות שעשויות לשאת אורגניזמים ברמה נמוכה (PSC) לשימוש באורגניזמים לא-FLT:0double אנטיביוטיקה FLT:1 (penin-stry) ו-i-icepti-Creatives-i-i-i-i-Creative) הם רק שינויים נפוצים יותר, אך ורק עבור כל אחד מ-Creativelyccinrccinrcious-Cremccinercious, אך ורק עבור שינויים באופן זמני, אך ורק עבור שינויים פסיכולוגיים נפוצים יותר.

חברת פיתוח Hygiene ו- Gas Supply Supply

ה- Incubator הוא סביבה חמה, לחמה שבה contaminantsשגשג.FLT:0Routine תחזוקה FLT:1 כולל wiping במורד המדפים והדלתות שבועיות, ניקוי מחבת המים עם חודשי חיטוי, והחלפת מסננים HEPA (אם מצויד) להמלצות יצרן. השתמש במחבת מים מקופח נחושת או להוסיף פתרון נחושת (0לא-לא-מתאי) ל-CO2 מיקרומטרה-מטרה-מטרה-מטרה-מטרה-מטרה-מטרה-מטרה-מטרה-חמצני) ל-מטרה-מטרה-מטרהחומרה-חמצני ל-N.

מסקנה

(התחילות בתרבות התא היא משמעת מתמשכת הדורשת תשומת לב לפרטים בכל שלב – מהעיצוב האדריכלי של המעבדה לאיכות האוויר ועד לשטיפת ידיים יומית של המפעילה ומנגב הסופי של הקבינט הבטחוני, על ידי זיהוי מקורות מרכזיים של זיהום תאים, אימוץ שיטות טיפול נמרץ, יישום ניטור שגרתי, והשקעה באימון כוח אדם, החוקרים יכולים להפחית באופן דרמטי את הסיכון להפסד תרבויות בסיסיות, כלומר: 1Frelimateercre: