שימוש ב- Flow Cytometry כדי לנתח את אוכלוסיית התאים בתרבות

ציטרינומטריה היא טכנולוגיה אבן הפינה בביולוגיה התא המודרנית, המאפשרת לחוקרים לנתח במהירות את המאפיינים הפיזיים והכימיקליים של אלפי תאים בודדים לשנייה.טכניקה זו חיונית לאפיון אוכלוסיות תאים בתרבות, מבדיקות פשוטות וכדאיות לאבחון רב-פרמטרים של אימונופולציה, על ידי שילוב של אורגניזמים נוזליים, אופטיקה, ואלקטרוניקה, זרימת אלקטרוניקה מספקת נתונים כמותיים, רב-ממדיים שמעמיקים של דינמיקה של תרופות תאוגניבות, כמונקומטיות, כמונקטיביות, תוך כדי דינמיקה של התפתחות פונקציונליות, כמונקולוגית, היא מתמקדת, כמונקולוגית, כמונקולוגית, היא מתמקדת, כמו גם מתודולוגיה, מתודולוגיה, מתודולוגיה, מתודולוגיה, מתודולוגיה, מתודולוגיה, מתודולוגיה, רזולוציה פונקציונליות של תרופות פונקציונליות של תרופות פונקציונליות, מתודולוגיה, .

מהו Flow Cytometry?

בליבתו, ציטריטום זרימה כרוך בהשעות תאים בנוזל הית' אשר מתמקדת בהם באופן הידרודינמי לתוך זרם חד-פרופיל יחיד. זרם זה עובר דרך נקודת חקירה - באופן חד-משמעי אחד או יותר של דבורים לייזר.כפי שכל תא מבודד את הלייזר, הוא מתפזר אור פולט ומפלט את הדגימות אם הוא נושא נוגדנים או צבעים שנוצרו על ידי זרם חיצוני (F) לפיזור אותות עצביים (מסוגים) על ידי שפעת (מסוגים ספציפיים של זמן) או שפעת (מסוגים) לאחר שגובה של שפעת (מסוגים) או שפעת (מסוגים) או שפעת (מסוגים) לאחר שגובה של שפעת (FDy) או נוזל חיצוני) על ידי שפעת (Ty) מתייחס לדגמיים (מסוגים) או נוזל חיצוני) על ידי שפעת (מסוגים (מסוגים של שפעת (מסוגים) על ידי שפעת (מסוגים) על ידי שפעת (מסוגים פנימיים (מסוגים פנימיים) או נוזל חיצוני) או נוזל של שפעת (מסוגים) לאחר שגודל של שפעת (מסוגים מסוימים (מסוגים) לאחר שגודל של שפעת (מסוגים בודדים (מסוגים) או נוזל חיצוני

הידרודינמיקה מתמקדת ותא זרימה

הלב של כל משטח זרימה הוא תא זרימה, נולאה אשר מאיצה את זרם הדגימה באמצעות נוזל הית' שמסביב.הלנדר זורם תאי פרופיל לתוך מרכז הזרם, ומבטיח תאורה לייזר עקבית. הידרודינמיקה נכונה מתמקדת במזער את clogging ומונעת כפולות או מצטברים מלהיות אירועים מודרניים.

מצגת: FSC ו-SSC

כאשר קרן לייזר מכה תא, אור מפוזר בכל הכיוונים.עבור פיזור (המצוין בזווית קטנה, בדרך כלל 1-10 מעלות) הוא פרופורציה לקוטר תאים והוא מדד הראשון הטוב של גודל התא. Side מפוזר (המצוין ב 90 מעלות) משקף מבנים פנימיים: תאים עם הרבה גרנוטים, כגון נויטרופילים, יש תגובות גבוהות SSC; לעתים קרובות להבחין בין דגימות דם גדולות.

גילוי פלואורסנס וניתוח רב-פרמטר

לניתוח ספציפי יותר, תאים מוכתמים עם פלואורפורפורחים - או ישירות נוגדנים conjugated, צבעי פלואורסנט (למשל, עבור תוכן DNA), או בדיקות תאי חיים (למשל, עבור סידן פלוקס) לכל אחד מתופעות לוואי של פלואופורטור (Solophore) יש ציטוט ייחודי וספקטרום פליטה של PM. cyt מודרני מצויד עם לייזרים מרובים (למשל, 4K) ו- nm) nm (nm) לתוך , nvate Cvate Cvate Cvate) לתוך , nvate Cvate C.

המונחים: key instrument Components

הבנת המרכיבים העיקריים של זרימת cytometer מסייעת לחוקרים לייעל הגדרות ובעיות לפתרון בעיות.

• מערכת (FLT:0) פלוידיקים: FLT:1Builds מדגם ונוזל הית' תחת לחץ מבוקר יש לשמור כדי למנוע בועות אוויר, חסמי אוויר, וזיהום צלב.
• (FLT:0)Optics: FLT:1 כולל לייזרים (מדינה פתורה, גז או דיודה), עדשות, מראות, ומסננים. כוח לייזר והתאמה ישירה של רגישות ויחס אותות-לא-רעש.
• (FLT:0) Electronics:FLT:1 PMTs להמיר photons לתוך אותות חשמליים. עיבוד אותות אותות אותות אותות אותות אותות כולל amplification (לינארי או דינמי), סף עיבוד הדופק עבור אפליה כפולה.
• (FLT:0) Data Acquisition and Analysis Software:FLT:1Build (למשל, BD FACSDiva, Beckman Coulter Kaluza, או חלופות קוד פתוח כגון FlowJo) הגדרות בקרה, נתוני אירוע שיא, ומאפשרות הורדת הזרם של גליזציה וויזואליזציה.

Fluorochromes and Panel Design: נמנעים ממלכודות

בחירת פלואורפורפורחים הנכונים עבור פאנל רב-צבעי הוא חיוני. פלואורפורפורפורחים אידיאליים יש פליטה בהירה, חפיפה מינימלית ספקטרלית, והתאמה עם קווי לייזר זמינים.Overlap מתרחשת כאשר טווח הפליטה של פלואורופור אחד שפך לתוך PMT המוקדש ל-Adamtre-to-to-to-to-to-rection מתמטי של אוכלוסיות חד-אופטיקה או פגום כראוי.

שיקול נוסף הוא (FLT:0)-minus-one (FMO) שולט ב-FLACLT:1 - דגימה מוכתמת עם כל הגויים למעט אחד. FMOs לחשוף את הרקע המקסימלי האפשרי להתפשט מפלואורפורפורפורחים אחרים לתוך ערוץ זה, אשר חיוני כאשר להבחין בין חיובי משלילים.

תוצאות ב- Cell Culture Analysis

ציטרימטריה זרימה מציעה ערכת כלים תכליתית עבור התאים בתרבות. להלן הם חלק מהיישומים הנפוצים ביותר, כל אחד דורש הכנה מדגם ספציפי אסטרטגיות שליטה.

הערכה של תאים

קביעת השבריר של חיים, אפופטומטיים, תאים מתים היא יסודית בניסויים רבים.וישויות צבע, כגון propidium iodide (PI) או 7-aminoactinomycin D (7-AAD), אינם נכללים על ידי מלמברנס שלם ובכך כתמים רק תאים מתים.

ניתוח Cell Cycle Analysis

תוכן DNA באמצעות צבעי פלואורסנט (propidium iodide, DAPI, Hoechst 33342) מגלה את שיעור התאים ב G0 / G1, S, ו G2 / M שלבים. A Histogram של תוכן DNA מראה שני שיאים: G0 / G1 שיא (2n DNA) ו- G2 / M העליון (4n DNA), עם תאים ביניים של Spha הוא מאפשר טיפול מדויק, כגון מדדים של תאים גנטיים, או ניתוח.

גילוי Aפופטוקוזיס

ציטרינומטריה של זרימה יכולה לטשטש מספר שלבים של אפופטוזיס.התצה הקלאסית משתמשת נספחin V congated to a fluorophore (למשל, FITC) כדי לזהות זרמנטל חיצוני אימות phosphatidylserine על הקרנת פלזמה (כמו JC) עם צבע חיובי כמו PI. תאים סרטניים מוקדמים הם נספח Vin+ חיובי, בעוד תאים כפולים (אופטיים) הם תאים כפולים).

עקבו אחרי Cell Proliferation Tracking

מעקב אחר תאים חלוקת לאורך זמן יכול להתבצע עם צבעים כמו carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) או CellTrace Violet. אלה צבעים נקשרים באופן שווה ל- intra amines והם מחולקים באותה מידה לתאי בתי על פי חלוקה.כל מחזור מפחית את עוצמת השפעת ההתפרצות הממוצעת על ידי בערך.לאחר כמה ימים, שיאים מופיעים על מספר כפול של תפוצה תאים זה משמש כדי הרחבה.

אלמוות

בתאי החיסון התרבותיים, זיהוי תת-קרקעיים על ידי סמנים משטח (למשל, CD4 לעומת CD8 בתאי T, CD19 בתאי B) הוא שגרתי.פאנלים כוללים לעתים קרובות 5-15 סמנים כדי להגדיר הפעלה, זיכרון, או מצבים רגולטוריים. כתמים אקסטרים סלולריים מבוצעים על תאים קיימא; אם חומרים cytokines או תמליל הם כדי למדוד (למשל, IF.N) חסימה מחייבת (p-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-to-defation) הם נדרשים) נוגדנים סטנדרטיתמתאים (מסוג) ו-PT) ל-PTcation) הם צמצום של נוגדנים סטנדרטיים (מסוג של נוגדנים סטנדרטיים (מתאים (מתאים (מסוגים) או ⁇ ) או ⁇ ) או ⁇ ) או גורמי דלקתיים (מסוג של נוגדנים (מתאים (מסוג של נוגדנים סטנדרטיים) או ⁇ ) הם הכרחי) או ⁇ ) הם הכרחי) ל-F.

CLECLING (FACS)

תאים מגובשים (FACS) מרחיבים ניתוח לטיהור.הנווטים של ה- Cytometer ליצור טיפות; המכשיר מטען חשמלי המכיל טיפות המכילות תאים רצויים ומרחיק אותם לתוך צינורות איסוף (או צלחות) משמר תאים תאים אם מבוצעים בתנאים סטריליים עם נוזל מתאים.

הכנת תאים ל- Flow Cytometry: Best Practices

ללא הכנת הדגימה הנכונה, אפילו הכלי הטוב ביותר אינו יכול לייצר נתונים אמינים.

1. (FLT:0) השעיית תאי גזע:FLT:1 ; Clumps לגרום לאירועים כפולים שיש לכלול במהלך גינון תאים מסננים באמצעות 40 מיקרומטר או 70 מיקרומטר מיד לפני הניתוח. אנזימים אנזים zymatic (למשל, לנסותפסיה / TA עבור תאים דבקים) חייב להיות עדין עדינים כדי למנוע אפיטופים מזיקים.
2. (FLT:0)Blocking:FLT:1 תאים עם סרום (ממין זהה נוגדנים משניים) או נוגדנים קולטנים Fc מטוהרים כדי להפחית את החייב לא ספציפי.
3. (FLT:0) נוגדנים לנטייה: FLT:1hil השתמש בהבדלים סדרתיים כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי אשר מביא את יחס האות הגבוה ביותר לרעש (לעיתים קרובות ריכוז מינימלי נותן הפרדה מקסימלית בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות).
4. (FLT:0)Staining:FLT:1 Incubate בחושך ב 4 מעלות C במשך 20-40 דקות (או כפי מומלץ על ידי היצרן) מנעו צעדים עם חיץ מתאים (PBS + 0.5% BSA + 2 m EDTA).
5. (FLT:0)Controls:FLT:1 Include unstained control, יחיד-stained בקרות עבור פיצוי, ו FMO בקרה על זיהוי גבולות שער. Isotype הם פחות אמין אבל יכול לשמש כדי להעריך לא ספציפי מחייב של נוגדנים ראשוני.
6. (FLT:0)Fixation:0) אם תאים לא יכולים לרוץ מיד, לתקן עם 1–4% paraformaldehyde ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. Note כי תיקון יכול לשנות תכונות פיזור, ועשוי להסוות אפיטופים מסוימים.

ניתוח נתונים ותוצאות אינטרpreting

ניתוח נתונים הוא תהליך של מזימה, גירוד, ומימון מחדש.זרימת העבודה הטיפוסית כוללת:

יצירת שער תאי חי

פליסה FSC-area (FSC-A) לעומת SSC-area (SSC-A) תאי חי בדרך כלל יוצרים אשכול ייחודי. Debris מופיע כאירועים קטנים, נמוכים-מקצרים; תאים מתים לעתים קרובות עוברים בפיזור.

2.פלפליט דיספלציה

פליסה FSC-A (area) לעומת FSC-H (height) עבור תאים בודדים. תאים בודדים ליפול לאורך דיגוני; לכפליים יש שטח גבוה יחסית לגובה. Alternatively, להשתמש FSC לעומת FSC-W (width). שלב זה הוא חובה כאשר ניתוח תוכן DNA או מיון.

פלואורופור-פיקוק גייטס

באמצעות הנתונים המבוזזים, העלילה כל ערוץ פלואורופור כנגד שליטה שלילית (למשל, FMO) לזהות אוכלוסיות חיוביות. עבור סמנים דו-ממדיים (למשל, CD4), השער פשוט. עבור סמנים מתמשכים (למשל, הפעלה), השתמש בקיצוץ מבוסס אוכלוסייה (למשל, 95 אחוזים מכלל שליטה שלילית) או התייחסות ביולוגית (כלומר, תאים HDR).

4 דיווח סטטיסטי

דווח על אחוז התאים בכל שער (בעבר משוכפל עם סטייה סטנדרטית) וכאשר מתאים, עוצמת פלואורסescence החציונית (MFI) או פירוש גיאומטרי.עבור מחזור תאים, השתמש בתוכנה מודלים כדי להעריך שברירי שלב.

בעיות נפוצות

Issue	Possible Cause	Solution
Low event rate or clogging	Cell aggregates or debris	Filter sample; add adequate EDTA; reduce cell concentration
High background fluorescence	Dead cells autofluoresce; antibody aggregates; insufficient blocking	Use live/dead gates; spin antibodies to remove aggregates; increase Fc block
Unstable baseline or drift	Temperature changes; air in fluidics; laser instability	Warm up instrument; prime fluidics; monitor laser power
Unexpected shifts in compensation	PMT voltage changed; different lot of antibody	Titrate new antibody; re-compensate each day; use consistent PMTs

הגבלות ושיקולים

בעוד ש-cytometry זרימה היא עוצמתית, יש לה מגבלות.הנתונים נאספים על תאים בודדים בהשעיה; ההקשר המרחבי (אדריכלות חתומה) אבוד.הטכניקה היא חצי-אנטיתטיבית; בעוד שהבדלים יחסיים ב- MFI הם חזקים, מספרים מולקולה מוחלטים דורשים כיבוד קלומים (למשל, לוחות הדמיה מולקולריים) גבוהים (15 צבעים) דורשים בקרה מתקדמת ופיצויים מתקדמים, עלייה של תאים, יתר עלות, יתר עלות, יתר עלות, יתר עלות, כלומר, או עלות, או עלות, כגון: תכונות הדמיה מולקולריות).

כיוונים עתידיים ב Flow Cytometry לתרבות תאים

(השדה מתפתח במהירות) (FLT:0) cytograph cytcioph1) מודד את ספקטרום פליטה המלא של כל פלואורופור במקום להסתמך על מסננים של להקות, המאפשר הפרדה טובה יותר של צבעי חפיפות והשימוש בפרמטרים נוספים בפאנל חד פעמי, אך לא ניתן לפיצול על פני כדוריות מהירות גבוהה, אם כי אם כי הם אינם יכולים לספק פיצויי דם גבוה יותר מ-אומטריה (CLT) באמצעות תאים חשמליים, אם כי הם מעל 40 ימים, אם כי הם עלולים, אם כי הם עלולים, אם כי הם יכולים לספק מחסנים של נוגדנים בטווח של דם גבוה יותר, אם כי הם מעל 40, אם כי הם אינם מסוגלים לספק, אם כי הם עלולים, אם כי הם מעל פני כדוריות, אם כי הם עלולים לפירוק של דם גבוה יותר, אם כי הם מעל פני כדור הארץ, אם כי הם מעל פני מחזור הדם של דם גבוה יותר, אם כי הם מעל פני מחזור הדם, אם כי הם עלולים, אם כי הם עלולים, אם כי הם עלולים, אם כי הם אינם יכולים להיות מופעלים, אם כי הם מעל פני מחזור הדם של דם גבוה יותר, אם כי הם יכולים לספק, אם כי הם מעל פני כדור

מסקנה

(התרגילים) cytometry נשאר כלי חיוני לניתוח אוכלוסיות תאים בתרבות.מבדיקות בסיסיות של immunophenoyping ו- Cell מיון, הוא מספק נתונים כמותיים, חד-תאים יחידניים שקשה להשיג באמצעים אחרים.יישומים מוצלחים דורשים לא רק להבין את עקרונות של יעילות וקידום איכות, אלא גם הכנה קפדנית, בקרה מתאימה, זהיר והנתונים הניקודמים באמצעות פרוטוקול מרכזי של תפוצה: