שימוש בלייזר לתפוס מיקרודיס סעיף לתאים ספציפיים בתרבות

הקדמה: הצורך בעדיפות ב- Cell Biology

הביולוגיה המודרנית דורשת יותר ויותר את היכולת ללמוד תאים לא כאוכלוסיות ממוצעות, אלא כשחקנים בודדים בתוך מערכות מורכבות.בין אם הם תומכים בנהגים הגנטיים של גידול, מטביעים את המעגלים העצביים של המוח, או מבינים כיצד תאי גזע שונים מבודדים, החוקרים דורשים שיטות לבודד סוגים ספציפיים של תאים עם דיוק כירורגי.

מאמר זה מספק סקירה טכנית מקיפה של LCM, מהעקרונות הבסיסיים שלה וזרימת עבודה צעד חכם ליישומים המגוונים שלה, אתגרים משותפים וחידושים מתעוררים. כתוב עבור חוקרים ואנשי מקצוע במעבדה, התוכן מדגיש אסטרטגיות מעשיות להשגת בידוד תאים באיכות גבוהה, ללא זיהום.

מה זה לייזר לתפוס מיקרודיסקציה?

לייזר ללכוד מיקרודיסקציה (LCM) היא טכניקה ללא מגע, מונחה מיקרוסקופית המשתמשת לייזר לחתוך ולבודד תאים ספציפיים או קבוצות של תאים מדגימה מוצקה רקמת תאים מונוטרה תאים.השיטה פותחה לראשונה באמצע שנות ה-90 במכון הלאומי לבריאות, בעיקר כדי לטפל בצורך באוכלוסיות תאים טהורות בגני סרטן.

העיקרון הליבה הוא ברור: חלק גולגולתי מוכתמת או מנה של תאים תרבותיים ממוקם על הבמה של מיקרוסקופ מיוחד מופנם.המפעיל רואה את הדגימה, מזהה תאים של עניין המבוסס על מורפיום, כתמים אלכימיים, או סמנים פלואורסנט, ולאחר מכן משתמש בלייזר הנשלט על ידי מחשב כדי לחתוך סביב תאים אלה.

(ב) ,0) מאפיינים של LCM כוללים: FLT:1

• (ב) רזולוציה מרחבית גבוהה: 0) 1 יכול לבודד תאים בודדים או קבוצות קטנות.
• (ב) נזק חד-צדדי:0 (FLT:1) האנרגיה של הלייזר ממוקדת בדיוק, צמצום הנזק התרמי לתאי הסמוכים.
• (ב) ויקרא: ויקרא י"א): "הנחה" (בראשית כ"ד) ו"הנחה" (בראשית כ"ד).
• (FLT:0) תאימות עם אסימסטר למטה: אנדרל 1) איסוף חומרים עם PCR, מיקרוריי, RNA-seq, ו-spectrometry המוני.

סוללת העבודה LCM: A Step-byStep- Guide

LCM מוצלח דורש תשומת לב זהירה לכל שלב של זרימת העבודה, ממתן דגימות לאיסוף. להלן הוא התמוטטות מפורטת של ההליך הסטנדרטי.

1.הכנה והתיקון

שמירה על הארכיטקטורה התאית ותוכן מולקולרי הוא רבתי.מרבית הפרוטוקולים ממליצים על (FLT:0flash-frozen רקמות FLT:1 מוטבע במתחם חיתוך אופטימלי (OCT), המחולקים עובי 5-10 מיקרומטר, ורכוב על ספויצית membran-coated (למשל, PEN או PET membrane) עבור תאים, הם בדרך כלל מוגדלים על גבי ריצוף קלושטמין, כי הוא עשוי להיות מצויד על גבי ⁇ ⁇ .

2.התמכה לויזואליזציה

כדי לזהות תאים של עניין, החלק הוא מוכת. Hematoxylin ו eosin (H&E) הוא הכתם הנפוץ ביותר עבור זיהוי מבוסס מורפולוגיה, אבל אימונוכימיה (IHC) או immunofluorescence (IF) ניתן להשתמש כדי לכוון סמנים חלבונים ספציפיים. Staining חייב להיעשות במהירות ובתנאים ללא RNase אם RNA הוא כדי לחלץ את פרוטוקול Hampylind ו-D.

בחירת מיקרוסקופיה ו- Target Selection

השקופית ממוקמת על שלב המיקרוסקופ של מערכת LCM.המפעיל משתמש במצלמת דיגיטלית ברזולוציה גבוהה ממשק תוכנה לסרוק את הדגימה.שימוש ב-Modernfield או הדמיה של פלואורסנס, תאים המתאימים לקריטריונים מוגדרים מראש (למשל, Ki-67-חיובי, GFAP-חיובי, או תאים עם גרעיניים אטומים) נבחרים על ידי ציור אזורים של עניין על מערכות המסך המודרני.

4. לייזר חיתוך (Dissection)

שתי טכנולוגיות לייזר עיקריות משמשות: FLT:0UV (ultraviolet) חיתוך לייזרים לוכדים 1 ו-FLT:2IR (infrared) ללכוד לייזרים לוכדים 3 (355 nm) ablate נתיב צר סביב התאים שנבחרו, חיתוך דרך הרקמה ו membrane.

5.אוסף של תאים מפוכחים

שיטות לאיסוף התאים המנושמים משתנים על ידי המערכת.

• (FLT:0) לחץ קטיפה (LPC): 1 1 דופק לייזר קצר באנרגיה גבוהה מרים את פיסת הרקמות החתך לתוך האוויר, שבו הוא נתפס על ידי צינור מכוסה דבק או מלא בbuffer.
• (ב) לכידתו של ה-[[1924]]: [[1924]]]], [[1924]]]], [[1924]]]], [[1924]]]], [[1924]]]]]], [[1924]]]]]], [[1924]]]]]], [[1924]]]]]]]], [[1924]]]]]]]], [[1924]]]]]]
• (ב) נפילה:0) , טיפת החיתוך נופל לתוך צינור ממוקם מתחת לרמה.

החומר שנאסף ממוקם מיד לתוך lysis buffer או לחלץ מדיום כדי לשמור על שלמות מולקולרית.

סוגים של LCM Systems

הבנת ההבדלים בין פלטפורמות LCM מסייעת לחוקרים לבחור את הגישה הטובה ביותר ליישום הספציפי שלהם.

Feature	UV Laser Cutting	IR Laser Capture
Laser type	Pulsed UV (355 nm)	Continuous IR (800 nm)
Mechanism	Photoablation (cuts tissue)	Thermal adhesion to film
Resolution	Single cell possible	Typically groups of cells
Speed	Fast	Fast (capture step)
Sample type	Thin sections, membranes	Thick sections possible
RNA preservation	Excellent (no heat)	Good (brief heat pulse)

מערכות מסחריות פופולריות כוללות את קרל Zeiss PALM MicroBeam (LPC מבוסס, קיצוץ UV), Leica LMD6/LMD7 (UV חיתוך, איסוף כבידה), ואת ה- ArcturusXT (המובא IR ו-UV) כולם תואמים עם מיקרוסקופיות שדה בהיר ושפעת.

יישומים מרכזיים במחקר ביולוגי

LCM כבר תפקיד מרכזי בקידום תחומים רבים. להלן דוגמאות ייצוגיות עם משמעות בעולם האמיתי.

סרטן Genomics ו Tumor Heterogeneity

גידולים סולידריות הם פסיפס של תאים ממאירים, תאים סטריליים, תאים חיסוניים, וvasculature. Bulk Sequencing יכול להסוות מוטציות נהיגה קריטיות להציג רק בתוך תת-מין. LCM מאפשר בידוד של תאים טהורים של גידולים טהורים מאזורים ספציפיים (למשל, מוטציות זעירות יותר, ליבות סימטריות, או נישות היקפית).

Neuroscience: Decoding Neural Circuits

המוח מכיל מאות סוגים תאים קבועים בקנה מידה מיקרוסקופי. LCM מאפשר לחוקרים לבודד נוירונים ספציפיים המבטאים סימן מסוים (למשל, צמיגיםrosine hydroxylase בנוירונים דופמין) מקטעים קפואים.זה איפשר את הסינון של ביטוי גנים בנוירונים תת-קרקעיים של פרקינסון או זיהוי של תת-סוגים עצביים ייחודיים ב ⁇ ⁇ ⁇ CM עם מנגנונים עצביים עמוק.

התפתחות ביולוגיה ו Stem Cell Research

במהלך העוברים, תאים עוברים שינויים גורל מהירים בתחומים מרחביים דיסקרטיים. LCM שימש לבודד את הגולגולת העצבית, לאוכורד, או גפיים מעוברים מוקדמים ללמוד תוכניות מיתעתיקות ספציפיות שלב.בתרבויות תאי גזע, LCM יכול לבודד מושבות נפרדות מבחינה מורפולוגית (למשל, בשפע לעומת מבדיל) לניתוח השוואתי ללא צורך בתאים FA, אשר יכול לבודד את התאים.

ניתוח DNA ארכיאולוגי וארכיאולוגי

LCM מתפתח ככלי בגנטיקה משפטית לאסוף מספרים קטנים מאוד של תאים (למשל, מדגימות דנ"א מגע או תאי זרע מכתמים מעורבים) עבור מטה הזרם קצר טנדם חוזר (STR) profiling.It הוא גם מיושם ב-Frephoogenomics כדי לבודד סוגים ספציפיים של תאים מרקמות מומיות או נשמרות, מצמצם זיהום של מיקרובים סביבתיים.

אתגרים משותפים ב-LCM

למרות כוחו, LCM דורש אופטימיזציה זהירה.האתגרים הבאים נתקלו לעתים קרובות, ניתן לצמצם עם פרוטוקולים מתאימים.

RNA Integrity ו-RNase Contamination

RNA הוא הביומולקולן המעבד ביותר.כדי לשמור על שלמות RNA, כל reagents ו שקופיות חייב להיות RNase-free. לעבוד בסביבה ללא RNase, להשתמש Diethyl pyrocarbonate (DEPC) מים מטופלים, ולשמור דגימות קר במהלך חיתוך (שימוש בשלב קר) הוא המספר RNA integrity (RIN) דגימות חזק (R) ו- Rantanid) לתוך gentiald (R.

המונחים: Surrounding Cells

מכיוון ש- LCM הוא חזותי, הסיכון של תאים לא רצויים הוא הגבוה ביותר לאורך הגבול לחתוך.לצמצם את הזיהום, לצייר את הנתיב לחתוך עם שולי 5-10 מיקרומטר הרחק מן תאי היעד כאשר אפשרי.עבור אוכלוסיות נדירות מאוד, גישה של שני שלבים (הראשון לחתוך אזור גדול יותר, ולאחר מכן לגרור הליבה טהורה) תמיד לאמת על ידי בדיקה מיקרוסקופית של החומר שנתפס או על ידי ניתוח קלפטים של תאים קטנים של טרה-מפסה עם תאים לא-מפס.

כמות הגבלת

LCM מניב כמויות קטנות מאוד של חומר - לעתים קרובות רק כמה מאות תאים או אפילו תא אחד. זה דורש שיטות מאוד רגיש למטה הזרם. עבור RNA, להשתמש בצעדים טרום-הפצה (למשל, הגדלה ליניארית או שיטות מבוסס PCR) אבל להיות מודע להטיה. עבור חלבונים, אות טכניקות הדגימה (למשל, tyramide amplification) או microscale-scale הם זקוקים מידע רב-מנטלי על פני אזורים שונים.

שיטות טובות ל- LCM מוצלח

בהתבסס על ניסיון ממעבדות רבות, ההנחיות הבאות מגבירות את שיעורי ההצלחה:

• (FLT:0)Optimize עובי סעיף: FLT:1 ; 7-7 מיקרומטר עבור RNA, 7-10 μm עבור DNA / חלבון.חלקים ת'יק לחתוך גרוע וסיכון RNA השפלה.
• (ב) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
• (ב) ,0) שמור דגימות קר: חתכים בטמפרטורת שלב של 20 מעלות צלזיוס כדי לדכא פעילות RNase.
• (FLT:0) לימיט זמן מכתים: 1FLT:1 Quick H&E או להשתמש ב- cresyl violet (0.5% למשך 30 שניות) כדי למזער את אובדן מולקולרי.
• (ב) ⁇ :0) ⁇ ⁇ (ב) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
• (FLT:0) לייזר מדי יום:FLT:1 כוח לייזר, מיקוד וחיתוך מהירות צריך התאמה לכל סוג של מדגם.

לקבלת התייחסות מפורטת, ראה פרוטוקול FLT:0LCM בפרוטוקול ExchangeFLT:1.

כיוונים עתידיים וחדשנות

תחום המיקרו-דיסקציה של לייזר מתפתח במהירות, מונע על ידי שילוב של טכנולוגיות מתקדמות.

אינטגרציה עם יחיד-Cell ו-ספאטי אומיס

הדור הבא של פלטפורמות ריצוף עכשיו לאפשר ניתוח תמליל של תאים בודדים LCM-captured. coupling LCM עם microfluidic או nanoliter בקנה מידה הפוך הוא מאפשר אמת מרחבי פתרון יחיד-תעתיקים תאים יחיד. בדומה, LCM הוא משולב עם הדמיה ספקטרומטריה המונית (MSI) לספק נתונים פרוטומטיים ומטבוליים של אותו סעיף רקמות.

אוטומציה ולמידה של מכונות

בחירת תאים ידנית היא זמן-consuming. תוכנה חדשה משלבת למידת מכונה כדי לזהות באופן אוטומטי סוגים תאים המבוססים על מורפולוגיה גרעינית או אגן אינטנסיביות. אלגוריתמים אלה יכולים לעקוב אחר גבולות תאים ולתכנן נתיבים חיתוך אופטימליים, עלייה דרך חישוב והתאמה מחדש.

Live-Cell LCM

באופן מסורתי LCM מבוצעת על דגימות קבועות או קפואות.חידושים אחרונים מאפשרים ללכוד תאים חיים ממאכלים תרבות באמצעות לייזר כוח נמוך IR כדי לצרף בעדינות תאים לסרט, אשר לאחר מכן הם תרבותיים או ניתחו.זה יש פוטנציאל למחקרי התרחבות משובט ובדיקת סמים על אוכלוסיות תאים טהורות.

Multimodal LCM

שילוב של LCM עם טכניקות מיקרוסקופיות אחרות (למשל, ראמן spectroscopy או MultiPhoton microscopy) מאפשר בחירה המבוססת על מאפיינים כימיים או מבניים ללא מכתים, שמירה על המדינה המולקולרית הילידים.זה חשוב במיוחד עבור דגימות עדין כגון רקמות צמחיות או חומר ארכיון.

חידושים אלה מפורטים בסקירות האחרונות, כגון:0.0.0.1 סיכום מקיף של יישומי LCM במחקר סרטן שפורסם ב- PMCFIRLT:1.

מסקנה

לייזר ללכוד מיקרודיס סעיף נשאר כלי חיוני עבור בידוד תאים ספציפיים מן הדגימות heterogeneous. היכולת שלה לשלב הדרכה מורפולוגי עם דיוק, retrieval ללא זיהום כבר פתח תגליות בgenomics סרטן, Neuroscience, ומעבר לכך, בעוד אתגרים כגון שימור RNA ותשואות נמוכות דורש אופטימיזציה, הטכניקה ממשיכה להתבגר, עם אוטומציה ו omics מרחביים רחב יותר כדי למנוע את השימוש הטוב ביותר של חומר דבקה.