Autophagy הוא מנגנון בקרת איכות סלולרי בסיסי המאפשר תאים לשרוד ולשמור על ההומוסטוזיס תחת תנאי הלחץ השונים נתקלו במהלך FLT:0in vitrophFLT:1 תרבות. על ידי degrading ומחזור איברים פגומים פגומים, חלבונים מעופלים, רכיבים cylasmic אחרים, autophagy מספק תגובה הישרדות דינמי כי הוא חיוני עבור יעילות ניסיונית והתאמה מחדש של מערכות בריאות מולקולרית יותר, אופטימיזציה תאים יעיל יותר, תכונות תרבות מולקולרית, ואפקטיביות יותר, שיפור משמעותי יותר, ואפקטיביות שלה.

מכונות מולקולריות של Autophagy

Autophagy ממשיך סדרה של צעדים מוסדרים הדוקים מעורבים מעל 30 חלבונים הקשורים אוטופג'י (ATG), שרבים מהם הם ספוגים באופן אבולוציוני מצעקות לבני אדם.התהליך מתחיל עם חניכה, שבו אותות תזונתיים או מתח גורמים היווצרות של מבנה הידרו-מברי כפול בשם phagophore. זה membrane מרחיב ו-engsulfysulficlassamssomectssomectssogicamed לאחר מכן, לאחר מכן, לאחר מכן, חלבון משוחררת, הוא מחוספסת, ולאחר מכן, ולאחר מכן, מחוספסת, מחוספסת, ולאחר מכן, מחוספסת, מחוספסת, הוא מחוספסת, מחוספסת, ולאחר מכן, מחוספסת, ולאחר מכן, מחוספסת, מחוספסת, ולאחר מכן, 000, 000, 000, מחוספסת, לאחר מכן, 000 מחוספסת, 000, 000 מחוספסת שומן sophasphas persopid sopomed, 000, הוא מחוספסת, 000, ולאחר מכן, 000, 000, 000, 000 מחוספסת, 000 משוחרר

Initation and the ULK1 Complex

הסרין / ndine kinase ULK1 (UNC-51- כמו kinase 1) הוא הרגולטור של רפואת autophagy. בתנאים עשירים תזונתיים, המטרה המכנית של rapamycin 1 (mC1) phosirphorylates ו inactivates ULK1. כאשר הם חומרים מזינים נדירים, mC1 הוא המאפשר אותות Uactamic כדי לגייס נקודה נוספת של 2Gopic היא השלב השני של שליטה (Grephic) ו-Factreopreamtic היא 2, הוא גם בשלב זה הוא 2, 000 נקודה נוספת של 2, 000 הוא 2, ו-Factrephic של phosylatesylatesylates.com) ו-Factivates ULK) ו-Factivasylatesylates.com (Gactivates ULK) הוא גם הוא לחץ דם מוקדם יותר של חומרים מזינים ULK) ו-Factiva הוא גם הוא לחץ דם מוקדם יותר של חומרים מזינים ULKeramtic בקרת מצב קריטי כדי להפעיל את זה הוא לחץ דם מוקדם יותר של חומרים מזינים ULK) ו-Factivasit (ב-Factivasylatesylate

Nucleation and the PI3K Complex

ULK1 מפעיל את ה-ACC III phosphatidylinositol 3kinase (PI3K) המורכב המכיל VPS34, Beclin-1, ATG14L, חלבונים אחרים. מתחם זה מייצר phosphatidylinositol 3 פוספט (PIP) על גבי phagophore membrane, אשר גייס חלבונים נוספים ב-ATG הדרושים עבור מסלול דלקת מפרקים 3 שימושי (D) או מעכב בשלב זה (3) כגון בשלב זה (3) של נוגדנים (D) או pgrargrargrambrargrambrargic) (334) על גבי PT) על גבי PT) על גבי PT) על גבי PT) על גבי pure membrargptgton) או מעכבת 3.

אורך ו Cargo Sequestration

שתי מערכות ההיגוי דמויות ubiquitin מניעות את הרחבת ה-phagophore ואת המתחם הסלקטיבי של המטען.המערכת הראשונה מייצרת את ה-ATG12-ATG16L1 המורכב, הפועל כ- E3-like ligase עבור המערכת השנייה: הדבקה של חלבון ה-microtubul-ciated 1A/1B-light 3 (n-R) ל-Ricial mepharcphas) של LCgoid (ה-R) היא מערכת ה-RICD2DLCD) עם LCRICDLCRICD) ה-RICD2, כלומר, כלומר, כלומר, כלומר, כלומר, לעומת LCRICDLCRICDOSDOSD, LCD, LCRICD, לעומת ALCD, LCRICD, LCR.

Fusion ו-Degradation

autophagosomes לנוע לאורך microtubules לכיוון lysosomes. Fusion הוא מתווך על ידי חלבונים SNARE (STX17, SNAP29, VAMP8) ואת המתחם hoPS tethering.פעם מבולבל, הסביבה חומצית ו lysomal מעכב את המטען אוטומפוזי, וכתוצאה מכך metabolites מועברים חזרה ל tomcin דרך פונקציה somic כגון ⁇ resomcin.

כיצד Autophagy תומך זמינות תאים בתרבות

בתרבות התאית, אפילו בתנאים המתאימים, תאים נחשפים ללא הרף ללחץ sublethal שיכול לפגוע ביומולקולות ואיברים. Autophagy פועל כהגנה מקדימה על ידי הסרת רכיבים פגומים אלה ולספק תת-שכבות מטבוליות.המנגנונים הבאים תומכים ישירות הישרדות תאים בתרבות.

מחזור חומרים מזינים תחת Serum ו- Glucose Starvation

פרוטוקולים תרבותיים סטנדרטיים רבים כרוכים בשינויים בינוניים כל 48-72 שעות, אך בין שינויים, זמינות תזונתית יכולה להשתנות.כאשר חומצות גלוקוז או אמינו מוגבלות, משחתות אוטופגיות שאינן חיוניות לתחזוקה של רכיבי תא סלולריים כדי לשמור על ייצור ATP וסינתזה מקרומולקולרית.מחזור זה קריטי במיוחד בתרבויות בעלות השפעה או גבוהות, שבו תחרות תזונתית היא תנאי סרום אינטנסיביים למחסור בכבדות.

Mitophagy ו- Mitochondrial Quality control

מיוצ'ונדריה היא האתר העיקרי של מינים חמצן תגובתיים (ROS) והם פגיעים במיוחד לנזק בתנאים תרבותיים (למשל, מ hyperoxia, phototoxicity, או מטבוליים על ידי מוצרים) מזיקים mitochondria יכול להדליף גורמים פרו-אפיטוטיים לייצר עודף של ROS, המוביל למוות.

ER-Phagy ו Proteostasis

ה-Reticulum (ER) הוא אתר מרכזי של סינתזת חלבון ואחסון סידן. במהלך התרבות, מתח פרוטנוכר - כגון זה המושרה על ידי DMSO, רמות גבוהות של אנטיביוטיקה, או pH תת-אופטימי - יכול לגרום ללחץ ERgy לשרוד את התגובה החלבון המתוכננת (UP). Autophagy תורמת ERostasis על ידי סלקטיבי של חלבונים אלה (בדומה) על ידי תאים סימפטומטיים בין תאים סרטניים (repted) לבין טיפול תרופתיים אחרים של דלקתיים (R) אשר שרדו את התגובה חלבון).

הסרתם של חומרים פגומים ו- Lysosomes

Peroxisomes לייצר מימן peroxide כתוצר לוואי של פונקציות מטבוליות שלהם, וlysosomes יכול להפוך permeabilized לאחר phagocytosis של תרכובות רעילות או לאחר עיכוב ממושך. Autophagy degrades אלה איברים פגומים (pexophagy ו lysophagy, בהתאמה), מניעת אנזימים מזיקים ו oxidative סוכנים לתוך irto זה חשוף לתרבויות ספציפיות.

מתחים בתרבות התא ו- Autophagy Activation

Autophagy הוא במהירות מואץ בתגובה מגוון של מתחים הקשורים לתרבות.הכרה אילו מתחים מעוררים אוטופג'יה - וכיצד - עוזר לחוקרים לשלוט על הפעלה בלתי מכוונת או דיכוי של המסלול.

המונחים: Deprivation

הסרת סרום או חומצות אמינו ספציפיות (במיוחד leucine, arginine, ו- glutamine) מעורר מאוד autophagy בתוך 30-60 דקות באמצעות עיכוב של mTORC1 והפעלה של ציר AMPK-ULK1.זוהי השיטה הנפוצה ביותר עבור autophagy חריפה induction בתרבות.

Hypoxia ו Oxidative Stress

מתח חמצן נמוך (hypoxia) מייצב את גורם ה- HIF-1α, אשר מעלה את BNIP3 ו- BNIP3L - חלבונים המקדמים את mitophagy ואת autophagy כללית. incubators סטנדרטי (בדרך כלל 5% CO2, 95% אוויר), רמות חמצן הן סביב 20%, אשר יכול להיות היפרקסיציפי בהשוואה לתנאי רקמות פיזיולוגיים (2–8%) זה יכול להפעיל לחץ דם מכני הוא לחץ דם מכני או טיפולי הוא איטי יותר.

השפעה, Senescence, ומגע תוך-הההביטיון

כאשר תרבויות הופכות לנפוצות, מעכבי מגע והפחתה של חומרים מזינים ומוצרי פסולת גורמים לדלקתיים. תאים סנט לצבור vesicles autophagic, חלקית בגלל תוכן lysososomal מוגבר וחלק בגלל הלחץ ההסתברותי מתמשך. חוקרים לומדים גיל תאים או quiescence צריך להיות מודע לכך שתרבויות גבוהות עשוי להיות מוגברות autoggic בהשוואה לאוכלוסיות בסיכון, פוטנציאל להיות מסוגלות.

מתחים כימיים וגופניים

הרבה תרבות reagents - כולל dimethyl sulfoxide (DMSO), אנטיביוטיקה, פנול אדום, מתכות כבדות - יכול לגרום autophagy במינונים גבוהים.אפילו מתחים מכניים כגון צינורות, אנליזציה, ו צנטריפוגה יכול לגרום הפעלה transientphagic.זה הוא תרגול טוב לכלול בקרת טיפול רכב וסטנדרט לטיפול כאשר autophagy הוא לנתח.

מניפולציה של Autophagy בתרבות התא

שיטת ה autophagy מבוקרת היא גישה ניסיונית רבת עוצמה ללמוד את תפקידה בהישרדות תאים, הבחנה ומחלות מודלים. הן כלי רוקחולוגי וגנטי זמין עבור אינדוקציה או מעכב.

ניכוי Pharmacological Induction

  • (ב) [15] , ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ : ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • (FLT:0) טורין 1 / PP242FLT:1: מעכבי mTOR ישירות ATP-competitive המייצרים אוטופגיה חזקה יותר מאשר אנסימיצין.
  • (FLT:0)Trehalose, זרע, ו resveratrolFLT:1: תרכובות טבעיות שגורמות לאוטומטי דרך מסלולים תלויי עו"ד (מפעילים מאק, חילוף החומרים פוליאמין).
  • (ב) ⁇ :0) ליתיום כלורד"מ: Inhibits inositol monophosphatase, צמצום רמות IP3 והפעלה של autophagy.

Inhibition

  • (FLT:0)Chloroquine / HydroxychloroquineeFLT:1: סוכנים ליסומוטרופיים שמגייסים pH lysosososososososososososososososososososososososososososososososososososososososososososomal וחסמו היתוך מדהים באופן אוטומטי.
  • (ב) [15] ,ב"מ, עיין ב': מעכב V-ATPase המונע חומצה lysososososososososososomal, המוביל להצטברות אוטופגומאלית.
  • (FLT:0)3-Methyladenine (3-MA)FLT:1: Inhibits PI3K פעילות חוסמת היווצרות autophagosome, אך גם מעכב מסלולים אחרים של PI3K, כך ספציפיות מוגבלת.
  • (ב) [15] ,0 (ל-ליסוזומאל מעכבי אימות ראט') (למשל, E64d בתוספת pepstatin A): חסימת ההשפלה ללא השפעה על ההיתוך; שימושית למדידת פלוקס אוטומטי.

מניפולציה גנטית

התערבות RNA או CRISPR-mediated גניבת גנים אוטופגיים חיוניים (ATG5, ATG13, ATG13, Beclin-1, LC3B) הוא תקן הזהב של מחקרים אוטונומיים (ATG5, ATG7, ATG13, ATG13, Beclin-1, LC3B) הוא תקן הזהב של מחקרים אובדן תפקוד (B) יכול לשפר את הביטויים של RLC-FIC) ללא FPD (GCR-F) ללא חשיפה אוטומטית) ללא FPD) ללא FPD) או RLCD) ללא FPDGCR-FPDGCRDGCR-FPDGCR-FICD) ללא FPD) ללא FPDGCRDGphas (RICDFICD) ללא חשיפה של RLCDGPTS) ללא FPDGphas (RICDGphas-FPD) ללא FPDICGphas בזמן ש-FPDICDICDGphas (RICGphas) ללא חשיפה של FPGphas) ללא FPDSTGphas) ללא FPGphas-FP

שיקולים ניסיוניים והפרקטיקה הטובה ביותר

הערכה מדויקת של autophagy דורש תכנון ניסיוני זהיר, במיוחד בגלל המדידות סטטיות של רמות LC3-II יכול להיות מטעה.

מכשיר אוטומטי Flux

פשוט לכמת LC3-II על ידי מערב נפיחות או אימונוכימיה לא להבחין בין ירידה מוגברת של autophagy והשפלה לקויה. למדוד פלוקס, לטפל בתרבויות במקביל עם מעכב lysosososososomal (למשל, bafilycin A1 או chloroquine) לפחות 4-6 שעות.

שליטה ומלכודות

  • (FLT:0Cell סוג variabilityFLT:1: Basal autophagy שונה מאוד בין קווי תאים (למשל, HEK293 לעומת HeLa לעומת פיברבסטולס ראשוני) תמיד כוללים חיובי (starved) וביקורת שלילית (מזין עשיר).
  • (FLT:0) Temperature ו- pHFLT:1: פלוקס אוטומטי הוא רגיש לטמפרטורה; לשמור דגימות על קרח במהלך עיבוד.שינויים ב- pH טרנספורמטיביים יכול להשפיע על פעילות lysosososososomal.
  • (FLT:0) איכות של סרום: ייצור פיג'ל בוץ (FBS) משתנה בין הרבה.שינוי בסרום יכול לשנות פעילות מ"ד ביים ורמות אוטופג'יה, כך לפני המסך הרבה חדשים.
  • (FLT:0) מספר המעבר מספרד"מ: Autophagy לעתים קרובות יורדת עם מעבר גובר בשל נזק סלולרי מצטבר שינויים אפיגנטיים.

טיפול ב- Autophagy and Disease Relevance in Cell-based Assays

מכיוון שאוטומטי היא מרכזית במחלות רבות – כולל סרטן, ניוון עצבי, steatosis hepatic ומחלות זיהומיות - מודלים של תרבות תאים שמצמצמצמים באופן נאמן תגובות אוטופגמיות הם בלתי הולמים לגילוי סמים ומחקרים מכניסטים.

מודל סרטן

תאים גידולים לעתים קרובות להציג בזיליקה גבוהה autophagy, אשר תומך הישרדות תחת hypoxic ו-זין-poor microenvironment של גידולים מוצקים.טיפוח תאים סרטניים תחת הגבלת מזון או עם סוכנים cheapeutic יכול לא להזיל תלות על autophagy עבור התנגדות.conversely, בהקשרים מסוימים (למשל, pancatic ducic ducotic ed אלה), כמו גם שיפור תפקודים של תרבות רגישה.

מודלים עצביים

תרבויות עצביות הן רגישות במיוחד ללחץ פרוטו רעיל בגלל האופי הפוסט-מיטי שלהם. חלבונים פרוגורג'יה כגון טאו, ⁇ lein, ופולילוטמין-מצפוי שלהם מטוהרים על ידי autophagy. בתרבות, שיפור autophagy עם ראפימיק או trehalose להפחית עומסים מצטברים ולהגן מפני רעילות, בעוד שהם מעכבים את הפיזיולוגיה שלהם.

מודלים hepatic ו- Metabolic

hepatocytes ו adipocytes להסתמך על autophagy עבור מחזור טיפות לימפוזה (lipophagy) ואת אינסולין איתותling.תרבות hepatocytes הראשי הההH-7 או HepG2 תאים משמשים בדרך כלל כדי ללמוד כיצד autophagy לווסת הצטברות שומנים תגובה חומצות שומן. כאשר להעריך flugic flux תאים אלה, תשומת לב מיוחדת חייב להיות שילם גבוה כדי שיעור מטבולי או בינוני באופן עצמאי.

כיוונים עתידיים

ההתקדמות בטכנולוגיית התרבות התאית מאפשרת מחקרים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית של מערכות אוטופג'י. Co-תרבותיות, פלטפורמות "אורגן-on-a-chip" ו-3D spids / אוורגואידים טוב יותר לשכפל את המיקרו-סביבון vivo, כולל ⁇ s של חומרים מזינים, חמצן, ומולקולות איתות כי באופן דינמי את הפעילות הגבוהה-באמצעות בדיקות הדמיה אלה הוא מגלה תאים אוטומטיים של גירוי אוטומטי.

מסקנה

Autophagy הוא חיוני להישרדות התא תחת הלחץ המעורפל של תנאי תרבות, ממגבלה תזונתית ונזק חמצון לתפקוד איברהל ו הלחץ פרוטמולי.על ידי הבנת המכונות המולקולריות של autophagy, לזהות את הלחץ המפעיל אותו, ולמידה כיצד לתמרן את המסלול עם דיוק, החוקרים יכולים לשפר את תוצאות התרבות התא, להפחית את יכולת הניסאית, לייצר נתונים כי הם משקפים באופן מדויק יותר את תהליך בדיקה גופנית של תפקוד חיוני של תאים.