Introduzione all'ingegneria cellulare basata su CRISPR

L'avvento della tecnologia CRISPR (CRISPR) ha trasformato in modo fondamentale come i ricercatori manipolano il genoma delle cellule coltivate. Con l'attivazione di modifiche precise e programmabili in quasi qualsiasi luogo in un genoma eucariotico, i sistemi CRISPR dominanti consentono agli scienziati di creare linee cellulari isogeni, eseguire schermi genomici funzionali e costruire modelli di malattia accurati in un piatto più veloce.

Questo articolo fornisce una panoramica tecnica completa dell'applicazione di CRISPR per modificare le celle colte. Copriamo i componenti fondamentali di CRISPR-Cas9, protocolli dettagliati per la consegna e la selezione, strategie di editing avanzate, trappole comuni, e innovazioni emergenti che stanno spingendo il campo in avanti. L'obiettivo è quello di dare ai ricercatori sia nuovi che esperti una guida pratica, pronta alla produzione per l'utilizzo di CRISPR nei flussi di lavoro di cultura cellulare.

Componenti principali di CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 è composto da due molecole essenziali: un Cas9 endonucleasi e un RNA guida singola (sgRNA). Il sgRNA contiene una sequenza di distanziatori da 20 nocleotide che è complementare alla regione del DNA di destinazione, seguita da un ponteggio che lega Cas9. Per Cas9 tagliare, il DNA di destinazione deve essere immediatamente seguito da un breve motivo adiacente protospaziale (PAM), tipicamente NGGGGG

I ricercatori possono progettare sgRNAs utilizzando strumenti come [CHOP per massimizzare l'attività on-target e minimizzare il potenziale off-target.Il DSB viene quindi riparato da uno dei due percorsi endogeni: non-homologous end join (NHEJ), che è errore-prone e introduce piccole inserzioni reporter o distruzioni (indele) che possono interrompere la funzione gene

NHEJ: Toccelli e Mutazioni di Indel

Per la maggior parte degli studi di perdita di funzionalità, NHEJ è il percorso preferito. Fornendo Cas9 e un sgRNA che mira un esone di codifica, i ricercatori generano una miscela di indele che causano i frameshift o i bachecheche prematuri. Dopo un periodo di recupero, le cellule sono clonato a singola cellula e sequenziato per verificare il knockout. Questo approccio è ampiamente usato per creare alleli nulli nelle linee cellulari per studiare l'essenziale, per studiare, la sensibilità, la ricercare, i percorsi di gene, segnalazione, segnalazione, e la terapia, segnalazione, segnalazione,

HDR: Toclini e modifiche precise

Quando è richiesta una modifica precisa, come l'inserimento di un tag fluorescente, una mutazione del punto, o un allele condizionale — HDR è impiegato. L'efficienza HDR nelle linee cellulari immortalate è tipicamente bassa (1-10%) e richiede la co-dividenziazione di un modello donatore. Il donatore può essere un oligonucleoto monostrato (ssODN) per piccole modifiche o un bracciolografico basato su plasmide.

Fornire componenti CRISPR in celle coltivate

Il successo di un esperimento CRISPR dipende fortemente dalla consegna efficiente della proteina Cas9 e sgRNA nel nucleo. Diversi metodi sono disponibili, ciascuno con vantaggi e limitazioni. La scelta dipende dal tipo di cella, dal budget e dal throughput desiderato.

Lipofezione

La lipofezione utilizza reagenti lipidi cationici per formare complessi con codifica del DNA plasmide Cas9 e sgRNA. È semplice e funziona bene per linee facili da trasfere come HEK293T, HeLa e molte linee cellulari tumorali. Tuttavia, la lipofezione è meno efficiente per le cellule primarie, le cellule staminali e le cellule di sospensione. La presenza di DNA plasmide può anche causare risposte innate.

Elettropopolazione

L'elettroporazione applica un breve impulso elettrico per permeabilizzare transiente la membrana cellulare, permettendo ai complessi di DNA, RNA o RNP di entrare. I sistemi moderni come il Lonza Nucleofector o Thermo Fisher Neon offrono alta efficienza anche nelle cellule di editing difficili da transfect, tra cui le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) e le cellule T.

Vettori virali

Per le cellule che sono refrattarie alla trasfezione, la trasduzione virale fornisce un'alternativa affidabile. I vettori lentivirali possono integrare stabilmente le cassette di espressione Cas9 e sgRNA, rendendole ideali per gli schermi CRISPR in pool.

Metodi basati su microiniezione e nanoparticella

La microiniezione è resistente al lavoro ma può raggiungere precisione a singola cella, spesso utilizzata per la modifica zygote nella produzione di animali transgenici. Più recentemente, nanoparticelle lipidi e nanoparticelle d'oro sono state sviluppate per la consegna transitoria di Cas9 mRNA e sgRNA, offrendo un'alternativa non virale con immunogenicità inferiore.

Selezione, arricchimento e convalida delle celle modificate

Dopo la consegna, solo un sottoinsieme di celle porterà la modifica desiderata. Le strategie di arricchimento sono essenziali per ottenere una popolazione pura per gli esperimenti a valle.

Reporter fluorescenti e FACS

Compreso un reporter fluorescente (ad esempio, GFP o BFP) nella cassetta di editing o utilizzando la co-delivery di un marcatore fluorescente separato permette la selezione FACS per isolare le celle modificate con successo. Per i busti HDR, le celle possono essere ordinati in base all'espressione del tag fluorescente, accelerando notevolmente l'isolamento clonale.

Antibiotici di selezione

Se viene introdotto un gene di puramicina, blasticidina o resistenza neomicina, la selezione antibiotica può arricchirsi rapidamente per le cellule modificate. Tuttavia, questo metodo non distingue tra le cellule che hanno integrato il gene di resistenza al locus di destinazione rispetto a eventi di integrazione casuale, quindi è necessaria una validazione aggiuntiva.

Genotipazione e convalida

Per cloni di ultima generazione, è consigliabile una combinazione di sequenziamento attraverso il sito di taglio e la blotting occidentale per la perdita di proteine. Per i busti, PCR di lunga gamma che spaziano sia le braccia di omologia può confermare la corretta integrazione, e la separazione di giunzione può escludere indele alle giunzioni di riparazione.

Applicazioni delle celle CRISPR-Modificata nella ricerca

La gamma di domande sperimentali che possono essere affrontate utilizzando le celle a celle a celle a celle a celle a celle a celle a celle a celle a celle a risonanza magnetica è vasta.

Schermi genomici funzionali

Gli schermi CRISPR in pool utilizzano librerie lentivirali contenenti migliaia di sgRNA per eliminare sistematicamente ogni gene nel genoma. Dopo la selezione di un fenotipo (ad esempio, la sopravvivenza cellulare sotto trattamento di droga o la resistenza all'infezione virale), la sequenziamento profondo dei sgRNA integrati identifica i geni che sono essenziali per il processo. Questo approccio è stato determinante per scoprire nuove vulnerabilità del cancro, fattori host per i principi attivi e le risposte patogene.

Modellazione di malattie con linee cellulari isogeni

Con l'introduzione di mutazioni specifiche del paziente in una linea di controllo delle cellule, i ricercatori creano modelli isogeni che differiscono solo alla mutazione di interesse. Questo elimina gli effetti di fondo genetici confondenti. Ad esempio, l'introduzione del BRCA1] 185delAG mutazione in MCF10A cellule epiteliali del seno permette uno studio preciso di come tale singola alterazione influisce la riparazione del DNA e la tumorigenesis.

Interferenza e attivazione CRISPRi/a

Cas9 (dCas9) fuso a reprimetori trascrizionali (ad esempio, KRAB) o attuatori (ad esempio, VP64) permette la modulazione dell'espressione genica senza tagliare il DNA. CRISPRi può mettere a tacere i geni con alta specificità, mentre CRISPRa può upregulare i geni endogeni. Questi strumenti sono particolarmente utili per studiare i geni essenziali per lo schermo.

Tracciamento e Barcoding di Lineage

Con la consegna di una libreria di sequenze di codici a barre uniche tramite HDR in un locus sicuro del porto, i ricercatori possono monitorare le dinamiche clonali delle popolazioni cellulari nel tempo. Questa tecnica, conosciuta come barcodifica CRISPR o CARLIN, rivela come le singole cellule contribuiscono alla differenziazione, metastasi o resistenza alla droga.

Sfide e Pitfalls Tecnici

Nonostante il suo potere, la modifica CRISPR nella cultura cellulare non è senza difficoltà, il riconoscimento e la mitigazione di queste sfide è fondamentale per i risultati riproducibili.

Effetti off-Target

Cas9 può tollerare errori nel sgRNA: DNA duplex, portando a modifiche non volute altrove nel genoma. Le mutazioni Off-target possono confondere l'analisi fenotipica e gli esperimenti a valle mislead. Strategie per ridurre al minimo gli effetti off-target includono l'utilizzo di versioni ad alta fedeltà Cas9 (ad esempio, eSpCas9, SpCasget-HF1), selezionando i risultati sperimentali

Efficienza HDR bassa

HDR è spesso inefficiente, soprattutto nelle cellule non dividenti o lentamente dividenti, perché richiede il modello donatore e il meccanismo di ricombinazione omologo attivo. Per migliorare HDR, i ricercatori possono sincronizzare le cellule in fase S utilizzando inibitori chimici (ad esempio, nocodazolo), utilizzare piccole molecole che sopprimono NHEJ (ad esempio, SCR7 o DNA-PKcs inibitori di proteina).

Mosaicismo e Variabilità Clonale

Anche dopo la clonazione a singola cella, non tutte le cellule di una popolazione possono portare la stessa modifica a causa di una prolungata espressione di Cas9 o di una riparazione in corso. Ciò è particolarmente problematico nelle cellule staminali. Limitare l'espressione Cas9 ad un breve impulso (utilizzando la consegna RNP o sistemi inducible) riduce il mosaicismo. Inoltre, è consigliabile verificare con attenzione la consistenza fenotipica.

Tossicità cellulare e stringa di consegna

Trasfezione, elettroporazione e trasduzione virale possono attivare risposte di stress cellulare, tra cui segnalazione di danno del DNA e apoptosi. Utilizzando protocolli ottimizzati, minimizzare la quantità di acido nucleico consegnato, e permettendo un adeguato tempo di recupero può migliorare la salute delle cellule.

Considerazioni etiche e regolamentari

Mentre la modifica delle cellule nella cultura per la ricerca di base rientra nella biosicurezza istituzionale standard e nelle linee guida del DNA ricombinante, diverse dimensioni etiche richiedono attenzione. Quando vengono utilizzati iPSCs umani o cellule staminali embrionali, è possibile che vengano richiesti ulteriori controlli da parte dei comitati di supervisione delle cellule staminali.

Le direzioni e le tecnologie emergenti

Il campo CRISPR continua ad evolversi rapidamente, e qui di seguito sono gli sviluppi chiave che promettono di ampliare ulteriormente la portata della modifica della cultura cellulare.

Modifica della base

Gli editor di base fussano un Cas9 cataliticamente alterato (nickase) ad un enzima deaminaso, consentendo la conversione diretta di una coppia di base ad un altro (ad esempio, C→T o A→G) senza richiedere un modello DSB o donatore. Questa tecnologia è ideale per modellare mutazioni di punto e correggere SNP patogeni in linee cellulari con alta efficienza e sottoprodotti indel minimi.

Prime Editing

Prime editing utilizza una Cas9 nickase fusa a una trascrizione inversa, insieme a una guida di editing principale RNA (pegRNA) che trasporta la modifica desiderata. Può introdurre inserimenti, delezioni, e tutte le 12 possibili conversioni base-base con pochissime modifiche off-target. Anche se la consegna nella cultura cellulare è più complessa, prime editing sta rapidamente acquisendo l'adozione per una precisa modifica genetica.

In Vivo Modifica e Modelli Organoidi

Un numero crescente di studi sta applicando CRISPR direttamente alle cellule all'interno di organoidi o iniettando componenti di editing in animali vivi. Ad esempio, la consegna dei componenti CRISPR tramite AAV nella retina o nel fegato dei modelli del mouse permette la correzione di difetti genetici [ in situ[]]. Combinando CRISPR con sistemi di cultura organoide 3D fornisce una piattaforma ancora più fisiologicamente rilevante per lo sviluppo e la malattia.

Modifica multiplexed e Biologia sintetica

Utilizzando più sgRNAs simultaneamente, i ricercatori possono modificare diversi geni contemporaneamente, consentendo la costruzione di circuiti genici sintetici o la modellazione di malattie poligenice. Sistemi come il nucleo MAD7 (Cas12a), che elabora la propria gamma CRISPR, semplificare la multiplexing. Inoltre, CRISPR può essere utilizzato per integrare grandi cluster di geni sintetici in loci di porto sicuro, aprendo la porta al comportamento cellulare di programmazione per il biomanufactu.

Considerazioni pratiche del protocollo

Per implementare la modifica CRISPR nella cultura cellulare, si consiglia il seguente flusso di lavoro:

  1. Progettazione 3–5 sgRNAs per obiettivo utilizzando algoritmi di previsione convalidati ([[]Doench et al., Biotecnologia della natura, 2016[).
  2. SgRNAs clona in un vettore di espressione (ad esempio, lentiCRISPRv2) o acquistare sgRNA sintetici modificati chimicamente.
  3. Consegnare Cas9 e sgRNA tramite il metodo più appropriato per il tipo di cella (elettroporazione RNP per le cellule staminali; lipofezione plasmide per HEK293T).
  4. Consenti 48–72 ore per la modifica, quindi raccogli il DNA genomico e esegui un test T7E1 o Surveyor per stimare l'efficienza di editing.
  5. Arricchire le celle modificate utilizzando un marcatore di selezione coespresso o FACS, quindi un singolo-cellula si seleziona in piastre 96-well.
  6. cloni di schermo da PCR e Sanger sequenziamento, e scegliere almeno due cloni indipendenti per la validazione fenotipica.
  7. Confermare la modifica on-target e controllare i siti di off-target di prossima generazione sequenziamento.

I protocolli dettagliati sono disponibili dal centro risorse di Addgene [, che offre plasmi, protocolli e guide di risoluzione dei problemi. Per schermi ad alto rendimento, la piattaforma di perturbazione genetica di Broad Institute fornisce ] librerie e strumenti di analisi sgRNA pre-progettati.

Conclusioni

La tecnologia CRISPR è diventata uno strumento indispensabile per modificare le cellule nella cultura, consentendo ai ricercatori di dissezionare la funzione genica, modellare le malattie umane con precisione senza precedenti, e sviluppare nuove strategie terapeutiche.