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Avanzamenti in Bioprinting Tecniche per la fabbricazione di Graft Vascular
Le malattie cardiovascolari rimangono la causa principale della morte in tutto il mondo, che porta un'urgenza di soluzioni efficaci di innesto vascolare. Mentre gli innesti autologo sono lo standard dell'oro, la loro limitata disponibilità e la loro morbilità del sito donatore hanno spinto una intensa ricerca in alternative di tessuto ingegnerizzato.
Questo articolo fornisce un approfondito esame delle attuali tecniche di biostampa per la fabbricazione di innesti vascolari, che coprono le principali piattaforme di stampa, le innovazioni materiali, l'integrazione dei fattori di crescita, il condizionamento meccanico e il percorso verso la traduzione.
L'imperatrice clinica per cespi vascolari ingegnerizzati
Le procedure di innesto di bypass dell'arteria coronaria sono eseguite annualmente in tutto il mondo, ma gli innesti sintetici come Dacron e il politetrafluoroetilene espanso rimangono subottimi per applicazioni di piccolo diametro (sotto 6 mm) a causa della trombosi, dell'iperplasia intima e dell'infezione.
Piattaforme di biostampaggio per la fabbricazione di cespi vascolari
Tre principali modalità di biostampaggio sono state adattate per l'ingegneria dei tessuti vascolari: a getto d'inchiostro, estrusione e biostampa assistita da laser. Ogni risoluzione dei bilanciamenti, velocità, viabilità cellulare e la capacità di elaborare bioinchiostri ad alta viscosità.
Biostampaggio a getto d'inchiostro
La biostampa a getto d'inchiostro utilizza attuatori termici o piezoelettrici per espellere gocce picolitriche di bioinchio su un substrato. Questo metodo offre alta velocità (fino a 10.000 gocce al secondo) e risoluzione fino a 20–50 μm, rendendolo adatto per la creazione di piccole strutture vascolari di diametro e reti capillari intricate.
Le recenti innovazioni includono l'uso di ugelli multiplo inkjet per depositare sequenziali diversi tipi di cellule (ad esempio, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce) per imitare gli strati di parete nativo del vaso.
Estrusione Bioprinting
La biostampa a estrusione impiega la pressione pneumatica o meccanica per estrudere filamenti continui di bioinchio attraverso un ugello. Questa tecnica può gestire una vasta gamma di viscosità (da 30 mPa·s a >107 mPa·s) e supporta l'uso di idrogeli a lamina di cellule, microcarrieri e formulazioni ECM decellulari.
Gli ugelli di estrusione coassiale sono stati sviluppati per stampare simultaneamente un nucleo di bioinchio e un guscio circostante, consentendo la creazione di strutture tubolari cavi in un unico passaggio.
Il principale svantaggio della biostampa dell'estrusione è la ridotta capacità cellulare causata dallo stress della cesoia durante l'estrusione, in particolare ad alte pressioni e piccoli diametri dell'ugello.
Biostampa laser-assisted
La biostampa laser-assista (LAB) utilizza un laser pulsato per vaporizzare uno strato assorbente sottile, generando un impulso di pressione che spinge una goccia di bioink su un substrato ricevente. Questo approccio senza ugelli elimina i problemi di intasamento e produce elevata capacità cellulare (spesso >95%) e una risoluzione eccellente (fino a 20 μm). LABCM è particolarmente adatto per la stampa di cellule ad alta densità
Poiché LAB è un processo seriale, il suo throughput è inferiore a quello dei metodi di inkjet o di estrusione, rendendolo meno pratico per la fabbricazione su larga scala. Tuttavia, LAB eccelle nella creazione di array di celle modellate e replicando precisamente architetture microvascolari.
Approcci ibridi e multi-tecnologie
Nessun metodo di biostampaggio unico può soddisfare tutti i requisiti di un innesto vascolare funzionale. I sistemi ibridi che combinano l'estrusione per la struttura di massa e l'inchiostro o LAB per le caratteristiche fini e la modellazione cellulare sono in fase di sviluppo. Ad esempio, un bioprinter con quattro teste di stampa può depositare sequenzialiamente una fibra polimerica rinforzante, un idrogelo a celle lamellate per i media, un materiale sacrificale per creare canali e uno strato finale di architettura trilate
Bioinchiostri per cesti vascolari: da idrogeli a materiali intelligenti
Il bioinchiostro è probabilmente il componente più critico negli innesti vascolari biostampati, che deve fornire un ambiente adatto per la sopravvivenza e la differenziazione cellulare, possedere sufficienti proprietà meccaniche per resistere alle pressioni fisiologiche e sostenere la formazione di rete vascolare.
Biomateriali naturali
Il collagene, la gelatina, la fibrina, l'acido ialuronico e l'alginato sono i bioinchi naturali più comunemente usati. Ciascuno ha vantaggi unici: il collagene fornisce le cue ECM nativo per l'attacco cellulare; la gelatina supporta la diffusione delle cellule ed è termoreversibile; la fibrina è una potente matrice angiogenica; e l'alginato consente un rapido crosslinking ionico per la stampa ad alta fedeltà dei polimerici.
I bioinchiostri estranei decellulari (dECM) preservano i segnali biochimici e biofisici specifici del tessuto. Il dECM dalle arterie porcine o dalle vene ombelicali umane può essere solubilizzato e riformulato in un gel stampabile che mantiene i fattori di crescita, il collagene, l'elastina e i differenziali glycosaminoglycans.
Polimeri sintetici e semisintetici
Polimeri sintetici come policaprolattone (PCL), poli (acido lattico-coglicolico) (PLGA), e poliuretano offrono proprietà meccaniche e degradazione controllata. Spesso sono stampati come un ponteggio sacrificale o rinforzante accanto agli idrogeli a cellule staminali.
Gli idrogeli poli (glicole etilene) (PEG) possono essere progettati con leganti bioattivi (ad esempio, peptidi RGD) e collegati tramite fotopolimerizzazione per ottenere il controllo spaziale e temporale sulla rigidità. Tali piattaforme permettono ai ricercatori di imitare il graduale irrigidimento associato a invecchiamento vascolare o malattia. Tuttavia, i polimeri sintetici non hanno la funzione intrinseca dei segnali covalenti di ECM naturale.
Bioinchiostri compositi e multimateriali
I bioinchiostri più avanzati combinano componenti naturali e sintetici per sintetizzare le loro proprietà. Una gelatina metacrilolica (GelMA) – PEG diacrylate (PEGDA) miscela, ad esempio, offre la biocompatibilità della gelatina con il crosslinking fotochimico e la robustezza meccanica del PEG. GelMA è particolarmente popolare per la biostampa vascolare a causa dei suoi motivi cell-adhesive e matrix metallo-proteina crosslinking.
Un altro approccio promettente incorpora microgel o nanofibra all'interno di bioinchiostri per migliorare la stampabilità e la resistenza meccanica senza sacrificare la viabilità cellulare. I idrogeli a sella e auto-riscaldanti che recuperano la loro struttura dopo la stampa sono anche in fase di sviluppo, consentendo la fabbricazione di geometrie complesse che altrimenti sarebbero crollate.
Additivi funzionali e la consegna del fattore di crescita
Incorporando fattori di crescita angiogenica come il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), il fattore di crescita fibroblasta di base (bFGF), e il fattore di crescita derivato dalla piastrina (PDGF) direttamente nei bioinchi possono accelerare la vascolarizzazione.
Progettazione della microarchitettura dei cespi vascolari
Oltre alla composizione dei materiali, l'architettura tridimensionale degli innesti biostampati influenza criticamente la loro funzionalità. I ricercatori hanno esplorato varie geometrie, dai tubi semplici alle reti ramificata, e hanno incorporato caratteristiche per guidare l'allineamento delle cellule e migliorare il trasporto di massa.
Costruzione da strato per strato della parete di vessel
Le arterie native sono costituite da tre strati distinti: la tunica intima (endotelio), i media di tunica (muscolo di liscio), e la tunica adventitia (tessuto connettivo).La biostampa permette la riproduzione di questa struttura a strati stampando sequenziali differenti bioinchi e popolazioni cellulari.
Tubi Hollow e reti Microchannel
La biostampa sacrificiale, utilizzando materiali come Pluronic F127 o gelatina, consente la creazione di reti di canali che possono essere successivamente perfuse per fornire nutrienti e ossigeno. Dopo la stampa del modello sacrificale all'interno di un idrogel di massa, il materiale viene rimosso dal cambiamento di temperatura o dissoluzione, lasciando dietro un lumen interconnesso.
Le architetture gerarchiche multi-scala che combinano i condotti di grande diametro con i microvessi ramificati sono essenziali per collegare innesti ingegnerizzati alla vascolatura dell'ospite. Uno studio di riferimento in ]Nature Biomedical Engineering]]]] ha dimostrato un costrutto biostampato contenente un arterio più piccolo centrale di 4 mm collegato a 12
Rinforzo meccanico e anisotropia
Gli innesti vascolari devono sopportare lo stress ciclico, lo sforzo longitudinale e lo stress della cesta dal flusso sanguigno. Le arterie native devono la loro anisotropia meccanica a collagene allineato e fibre elastin che sono crimpate in un modello elicoidale.
Il rinforzo con fibre elettrospun o polimeri sintetici stampati migliora ulteriormente la pressione e la ritenzione di sutura. Un innesto ibrido con uno strato interno GelMA-HUVEC e una rete microfilamento esterna di PCL ha raggiunto una pressione di scoppio di oltre 1200 mmHg, superando la tipica gamma arteriosa (200–300 mmHg).
Bioreattori e strategie di maturazione
Dopo la biostampa, l'innesto deve essere maturato in un ambiente biomimetico per sviluppare la forza e la funzione del tessuto. I bioreattori che applicano il flusso pulsale, la stretching ciclico e la stimolazione elettrica accelerano la deposizione e l'allineamento cellulare dell'ECM.
Bioreattori perfusione
La perfusione con il mezzo culturale a pressioni fisiologiche (sistolico da 80 a 120 mmHg, diastolico da 60 a 80 mmHg) promuove l'allineamento delle cellule endoteliali nella direzione del flusso, aumentando la resistenza allo stress e riducendo la trombogenicità.
Stimuli dinamico elasticizzati ed elettromeccanici
La stretching uniaxial o biassiale dell'innesto durante la cultura migliora ulteriormente l'anisotropia dei tessuti. Combinato con stimolazione elettrica (specialmente per le cellule muscolari lisce), i bioreattori possono guidare l'espressione di marcatori maturi come l'actina muscolare α-smooth, la calponina e la catena pesante myosin.
Strategie di endotelializzazione
Un endotelio confluente e non tombogeno è essenziale per la paternità dell'innesto. Mentre la semina delle cellule endoteliali nel lume dopo la stampa è comune, in situ endotelializzazione—dove il innesto cattura le cellule endoteliali circolanti progenitori (EPC) dal flusso sanguigno—è un'alternativa attraente perché evita i ritardi della cultura vitro.
Sfide in scala e traduzione clinica
Nonostante i progressi notevoli negli studi di laboratorio, traslando innesti vascolari biostampati alla pratica clinica affronta diversi ostacoli. I più pressanti sono scalabilità, sterilizzazione, stabilità a lungo termine e approvazione normativa.
Riproducibilità della scalabilità e della produzione
La maggior parte degli studi di biostampa produce innesti di lunghezza da 5 a 10 cm e diametro da 3 a 6 mm. Scalare fino alle lunghezze richieste per bypass femorale dell'arteria (fino a 60 cm) o innesti coronari (15-20 cm) richiede volumi di stampa più grandi e tempi di fabbricazione più lunghi che rischiano la vitabilità cellulare e la degradazione del bioinchiostro.
Sterilizzazione e conservazione
La sterilizzazione terminale degli innesti vivi e strutturati senza compromettere la stabilità cellulare è un ostacolo importante. L'irradiazione del fascio di elettroni, l'ossido di etilene e la radiazione gamma a dosi standard uccidono le cellule mammiferi. Alternative come la sterilizzazione supercritica di CO2 o i cocktail antibiotici richiedono la convalida. Alcuni gruppi stanno sviluppando innesti biografici decellulari che possono essere sterilizzati terminalmente e poi ricellularizzati.
La conservazione degli innesti biostampati per lo stoccaggio e il trasporto è un'altra sfida: la vitrificazione con crioprotettori permette il congelamento dei costrutti a celle-laden, ma la presenza di grandi volumi idrogel può portare a cristallizzazione e danni del ghiaccio.
Risposta immunitaria e Patenza a lungo termine
Anche con le cellule autologo, i materiali impalcabili possono provocare reazioni del corpo estranee. I crosslinker residenziali, frammenti di polimeri degradati e contaminanti possono innescare infiammazioni croniche, fibrosi e occlusione dell'innesto. L'uso di matrice decellularizzata o materiali altamente biocompatibili aiuta, ma la risposta immunitaria alle cellule allogeneiche (se utilizzate per i prodotti commerciali fuori dalla superficie) deve essere gestita con immunosoppressione o incapaci.
La paternità a lungo termine di innesti biostampati in grandi modelli animali (peco, suini) è stata segnalata per un periodo di 12 mesi, ma non sono stati completati studi clinici umani. Iperplasia neointimale nei siti anastomotici rimane un problema, guidato da un errore di conformità tra l'innesto e l'arteria nativa.
Direzioni future: Bioinks intelligenti, Stampa in Situ e Apprendimento della macchina
Bioinchiostri corrosivi e degradabili
La prossima generazione di bioinchiostri incorporerà moieties stimolanti-responsive che alterano la rigidità, degradano in risposta all'attività enzimatica o rilasciano agenti terapeutici su richiesta. "Bicografia 4D" dove il costrutto stampato cambia forma nel tempo in risposta al calore, al pH, o alle api igieniche possono produrre tubi auto-rotolanti o strutture auto-anastomotive che semplificano l'impianto.
In Situ Bioprinting
I bioprinter portatili che depositano il bioinchiostro direttamente su un sito di ferita o di difetto vascolare sono in fase di sviluppo. Questo approccio potrebbe eliminare la necessità di innesti prefabbricati e consentire lo stampaggio personalizzato all'anatomia del paziente. Per applicazioni vascolari, nella stampa situ di un tubo di piccolo diametro su un vaso sanguinante potrebbe servire come sigillante o conduit.
Imparare l'intelligenza artificiale e la macchina nella biostampa
Grazie alla formazione su grandi dataset di risultati di stampa, i modelli possono prevedere la velocità ottimale dell'ugello, la pressione e la temperatura per un dato bioink, o la probabilità di una viabilità cellulare basata su profili di stress.
Conclusioni
La biostampa è maturata da una tecnologia di proof-of-concept in una piattaforma versatile per la fabbricazione di innesti vascolari che ritraggono strettamente l'architettura dei tessuti nativi.
Poiché le tecniche di biostampa continua a migliorare, la collaborazione interdisciplinare tra scienziati di materiali, biologi, ingegneri e clinici sarà essenziale per superare le barriere rimanenti. Con un investimento sostenuto e una previsione normativa, innesti vascolari biostampati potrebbero diventare una terapia standard per le malattie cardiovascolari, riducendo la dipendenza da protesi sintetiche e tessuti donatori, e infine migliorare i risultati per milioni di pazienti in tutto il mondo.