Le malattie croniche del fegato colpiscono milioni di persone in tutto il mondo, e quando un paziente progredisce per l'insufficienza epatica finale, l'unico trattamento definitivo è il trapianto di organi. Tuttavia la domanda di fegato donatore supera di gran lunga l'offerta, con migliaia di pazienti che muoiono su liste di attesa ogni anno.

Il bisogno critico dei tessuti del fegato vascolarizzati

Le malattie del fegato, tra cui la cirrosi, l'epatite virale, la malattia del fegato non alcolica e il carcinoma epatocellulare, sono tra le cause principali della morte a livello globale. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, le malattie epatiche causano oltre due milioni di morti ogni anno. Per i pazienti con insufficienza epatica acuta o cronica, il trapianto è lo standard d'oro, ma il numero di organi donatori disponibili è altopianto più altopianto mentre la domanda continua a salire.

Un'alternativa valida sarebbe quella di progettare il tessuto epatico funzionale che può essere impiantato direttamente nel paziente, ripristinando la funzione senza la necessità di un intero organo. Tuttavia, per il tessuto epatico progettato per sopravvivere dopo l'impianto, deve avere una rete vascolare incorporata, vasi sanguigni che si connettono alla circolazione vascolare del paziente e forniscono ossigeno e sostanze nutritive.

Comprendere la biostampa di Liver Lobules

La biostampa è una tecnica di produzione additiva che deposita cellule viventi, fattori di crescita e biomateriali in precisi modelli tridimensionali per ricreare l'architettura dei tessuti nativi. Per i lobuli epatici, le unità funzionali esagononali del fegato che tipicamente misurano circa uno a due millimetri di diametro - biostampa mira a replicare l'intricato disposizione degli epatociti, bile canaliculi e la produzione di reti metaboliche

L'architettura biologica di un Liver Lobule

Per apprezzare la sfida, si consideri la microstruttura del fegato naturale. Un singolo lobule è organizzato intorno a una vena centrale, con piastre di epatociti che irradiano verso l'esterno come i raggi su una ruota. Tra queste piastre cellulari sono i sinusoidi – canali simili a quelli della capillaria foderati di cellule endoteliali e cellule Kupffer – che portano il sangue dal tratto del portale alla periferia verso la vena centrale.

Componenti chiave di Lobuli per fegato biostampati

La biostampa di un lobulo vascolarizzato richiede un'attenta selezione di tipi di cellule, biomateriali e metodi di stampa.

  • Epatociti:[] Le cellule elementari parenchimali del fegato, responsabili delle funzioni metaboliche tra cui la disintossicazione, la sintesi proteica e la produzione bile. Gli epatociti umani primari sono lo standard dell'oro, ma sono difficili da espandere nella cultura; indotte cellule staminali pluripotenti (iPSC)-derived sono un'alternativa promettente.
  • Le cellule endoteliali: Le cellule che mettono in fila l'interno dei vasi sanguigni. Per i sinusoidi, le cellule endoteliali sinusoidi epatiche (LSEC) sono ideali perché formano capillari fenestrati che permettono il passaggio selettivo delle molecole. Le cellule endoteliali della vena umana (HUVEC) sono spesso utilizzate come sostitutivi nei primi stadi.
  • Bioink Extracellular matrix (ECM): Un idrogel che imita il fegato naturale ECM, fornendo supporto strutturale e cue biochimiche. I bioinchi comuni includono collagene tipo I, gelatina methacryloyl (GelMA), alginato, acido ialuronico e decellularizzato ECM del fegato.
  • Le cellule di sostegno:[] Le cellule stellate epatiche e le cellule Kupffer possono essere incluse per emulare meglio le funzioni del fegato e del sistema immunitario, anche se molti costrutti attuali si concentrano sull'accoppiamento epatocite-endoteliale.
  • Canali vascolari:[ Durante il processo di stampa, un bioink sacrificale (ad esempio, una gelatina o Pluronic F127) può essere depositato nel modello dei vasi sanguigni desiderati e successivamente rimosso dal riscaldamento o dalla dissoluzione gentile, lasciando dietro un lumen cavo che può essere semenzato con celle endoteliali per creare una rete di vasi brevetta.

Tecniche di stampa: dall'estrusione ai metodi basati sulla luce

Diversi strategie di biostampa sono impiegate per fabbricare lobuli epatici:

  • Biostampaggio estrusione:[ Un sistema pneumatico o meccanico spinge un idrogel a celle a carico attraverso un ugello in un modello controllato. Questo metodo può produrre grandi costrutti ma può sottoporre le cellule allo stress di taglio.
  • Drop-on-demand (inkjet) biostampa:[] Utilizza impulsi termici o piezoelettrici per espellere piccole gocce di bioinchiostro. Offre alta risoluzione ma ha densità cellulari più basse ed è più adatto per modellare i fattori di crescita o uno strato sottile di cellule.
  • Biostampa a luce (DLP e SLA): La lavorazione digitale della luce (DLP) e la stereolitografia (SLA) utilizzano la luce focalizzata per fotopolimerizzare lo strato di bioinchiostro per strato. Queste tecniche forniscono una risoluzione eccezionale (fino ai micrometri) e sono ideali per catturare dettagli fini come bile canaliculi.
  • Estrusione coassiale:[] Un sistema a doppia ugelli che stampa simultaneamente un nucleo e una shell—utile per creare un canale (corona a collo) incorporato all'interno di una conchiglia idrogel a celle, un approccio comune per la stampa diretta di canali vascolari.

Combinando queste tecniche, ad esempio, utilizzando DLP per modellare le piastre epatocite e l'estrusione per formare la vena centrale più grande, consente ai ricercatori di costruire un lobule gerarchicamente organizzato con la risoluzione e la scala necessarie. A 2019 recensione in Nature Recensioni Materials]]] evidenzia come l'integrazione multi-tecnica sta spingendo il campo verso costrutti epatici anatomicamente accurati.

Rivolgersi alla sfida della vascolarizzazione

La vascolarizzazione è il solo più grande ostacolo alla creazione di tessuto epatico trapiantabile. Senza un'alimentazione di sangue perfusabile, qualsiasi tessuto più spesso di circa 200 micrometri soffrirà di ossigeno e privazione di nutrienti al suo nucleo. Nei lobuli epatici, la rete sinusite naturale assicura che ogni epatocito sia entro poche larghezze di sangue.

Strategie per la costruzione di reti vascolari

I ricercatori hanno sviluppato diversi approcci per creare lobuli vascolarizzati:

  • Templatura disacratica:[] Un materiale di formatura di canale (come la gelatina o una cera capillare dell'acqua) viene stampato nella geometria del vaso desiderato e poi rimosso, lasciando un tubo cavo. I canali vengono successivamente endotelializzati mediante la semina con celle endoteliali. Questo metodo funziona bene per i vasi di grandi diametro (ad esempio, una vena centrale o una scala porta vena.
  • L'incorporazione del letto vascolare:[] Una rete microvascolare preformata, come un ponteggio d'organo decellularizzato o un chip microfluidico, viene utilizzata come ponteggio su cui vengono semiati gli epatociti. La struttura del vaso esistente può essere poi ri-endotelializzata.
  • In situ vascolarizzazione:[ Il costrutto è impiantato e si basa sulla risposta angiogenica dell'ospite per crescere nuovi vasi nel tessuto. I fattori di crescita come VEGF possono essere incorporati nel bioinchio per attirare germogli endoteliali. Tuttavia, questo processo può richiedere giorni o settimane, e il nucleo di un costrutto spesso può diventare necrotico prima che i vasi invadono.
  • Stampa coassiale:[] Come accennato, un ugello all'interno di un ugello consente la deposizione simultanea di un nucleo senza cella (per diventare un recipiente) e di una shell esterna a celle-laden.

Uno studio di riferimento pubblicato in ]Science Advances[] ha dimostrato la biostampa di un tessuto epatico di centimetri contenente una rete vascolare di brevetto che potrebbe essere perfusa con sangue []]. Dopo il trapianto in topi, i vasi collegati con la circolazione entro una settimana, e le funzionalità mantenute per le settimane epatocite.

Sfide di biostampa oltre la vascolarizzazione

Mentre la vascolarizzazione è l'ostacolo più importante, diversi altri ostacoli devono essere superati prima che i lobuli epatici biostampati possono essere utilizzati nei pazienti.

Fonte cellulare e espansione

Gli epatociti umani primari sono il tipo di cellule preferito perché sono completamente differenziati e possiedono tutte le funzioni native. Tuttavia, non proliferano bene nella cultura e sono tipicamente raccolti dal tessuto donatore che è anche in breve fornitura.

Formulazione Bioink

Il bioink ideale deve sostenere l'alta viabilità cellulare durante la stampa, fornire l'integrità strutturale per mantenere la forma complessa del lobule, e degradare al tasso giusto per consentire alle cellule di rimodellare la matrice. Deve anche avere le proprietà meccaniche giuste - troppo rigide e le cellule perdono la funzione, troppo morbido e il costrutto crolla.

Reiezione immunitaria

Anche con iPSCs derivati dal paziente, c'è il rischio di rifiuto del sistema immunitario se le cellule non sono perfettamente abbinate o se il biomateriale stesso provoca una risposta del corpo straniero. I costrutti Allogeneici richiederebbero immunosoppressione simile a trapianti interi di organi. Un viale è quello di indurre la tolleranza immunitaria o di progettare cellule che "nascosto" dal sistema immunitario (ad esempio, esprimendo proteine di controllo immunitario via).

Riproducibilità della scalabilità e della produzione

Per un trapianto, si dovrebbe avere bisogno di un segmento di tessuto contenente centinaia di lobuli – diversi centimetri cubi in volume. La produttività attuale del bioprinter non è sufficiente per costruire un costrutto così grande e ad alta risoluzione abbastanza rapidamente per mantenere la capacità di produzione cellulare.

Ultimi sviluppi e emergenti frontiers

Nonostante gli ostacoli, il ritmo di progresso nella biostampa epatica sta accelerando, e sono particolarmente importanti alcuni progressi recenti.

Perfusione microfluidica in Bioreattori

I bioreattori che perfondono i canali vascolari con il mezzo di cultura ossigenata hanno dimostrato di migliorare drammaticamente la funzione epatocita. I ricercatori del Wyss Institute di Harvard hanno sviluppato una perfusabile piattaforma di test epatica-on-a-chip contenente una vena centrale biografica e dei sinusoidi; il chip ha mantenuto l'albumina e i tempi uredici.

Biostampa con gli organicidi iPSC-Derived

Gli organidi, che si organizzano in modo autonomo, possono essere utilizzati come "blocchi di costruzione" all'interno di impalcature biostampate. Ad esempio, i organoidi epatici contenenti epatociti, collangiociti e cellule stellate sono stati stampati in strutture di ingegneria reticolare.

In Vivo Efficienza e Modelli Preclinici

Ad oggi, la maggior parte dei tessuti epatici biostampati è stata testata in piccoli modelli animali (mice e ratti). Diversi gruppi hanno dimostrato che i costrutti impiantati possono integrare con la circolazione degli ospiti e produrre proteine del fegato specifiche per l'uomo, come l'albumina e l'antitriptina alfa-1.

Traduzioni cliniche e percorsi regolamentari

Negli Stati Uniti, la FDA potrebbe classificare un prodotto simile a un prodotto combinato (dispositivo + biologico), che richiede un'applicazione di Nuovo farmaco (IND) di indagine o un Esenzione di dispositivo. Prove di sicurezza, sterilità, assenza di tumorigenicità e produzione coerente sarà obbligatoria.

Un'applicazione più a breve termine è l'uso di lobuli epatici biostampati come modelli disinfettanti e piattaforme di schermatura della droga[. Questi dispositivi "liver-on-a-chip" possono incorporare cellule specifiche del paziente per modellare le malattie epatiche genetiche o per testare la tossicità della droga.

Prospettive future

La biostampa di lobuli epatici vascolarizzati sta avanzando lungo due binari paralleli: uno mira al trapianto e l'altro alla modellazione in vitro. Mentre l'obiettivo di trapianto rimane ambizioso, la convergenza di nuove formulazioni bioink, stampanti multi-materiali ad alta risoluzione, e la differenziazione delle cellule staminali migliorata sta spostando il campo con una velocità crescente.

I lobuli futuri possono incorporare non solo epatociti e cellule endoteliali, ma anche cellule biliari per creare un sistema di drenaggio biliare completo e cellule immunitarie per creare un ambiente più fisiologico. L'obiettivo finale - un lobo epatico trapiantabile e vascolare che può sostenere la vita in un paziente con insufficienza epatica - è ancora anni dalla realtà, ma ogni progresso incrementale lo avvicina.

La promessa di ridurre la dipendenza dagli organi donatori e di offrire speranza ai milioni di persone in attesa di un trapianto è un potente motivatore. Con un investimento continuo e una collaborazione interdisciplinare, la lobula epatica biostampata può un giorno diventare uno strumento di routine nella battaglia contro la malattia epatica di fine stadio.