La cromatografia è una delle tecniche più indispensabili nella chimica analitica, che consente agli scienziati di separare, identificare e quantificare i componenti all'interno di miscele complesse. Se in sviluppo farmaceutico, monitoraggio ambientale o test di sicurezza alimentare, la potenza della cromatografia è nella sua capacità di risolvere composti simili attraverso sottili differenze nelle loro interazioni con fasi stazionarie e mobili.

Che cosa è l'assorbimento in cromatografia?

Nella cromatografia adsorbimento, le molecole nella fase mobile competono per i siti di legame nella fase stazionaria. L'analisi (la sostanza essendo separata) adsorbi alla superficie della fase stazionaria attraverso le forze intermacolari, mentre la fase mobile scorre oltre, portando componenti non assorbiti o meno assorbiti in avanti. La forza e la specificità dell'interazione di adsorbimento determinano quanto tempo lungo ogni composto rimane sulla colonna.

È importante distinguere l'assorbimento da ]. In assorbimento, una sostanza penetra nella maggior parte di un solido o liquido (come una spugna che assorbe l'acqua). In cromatografia, l'assorbimento è un fenomeno superficiale: le molecole di analiti rimangono sulla superficie esterna delle particelle stazionarie.

Il concetto di adsorbimento in cromatografia risale al primo lavoro di Mikhail Tswett, che nel 1903 separava i pigmenti vegetali usando una colonna di carbonato di calcio. Il suo lavoro ha posto la base per capire che l'assorbimento differenziale dei composti porta a bande colorate distinte, le fasi originali di "cromatografia" (scrittura di colore).

Meccanismi dell'assorbimento

L'assorbimento nella cromatografia può essere ampiamente classificato in due meccanismi primari basati sulla natura delle interazioni tra l'analita e la fase stazionaria: assorbimento fisico (fisiorpzione) e ] assorbimento chimico (chemisorption)].

Adsorbimento fisico (Physisorption)

La fisioterapia si basa su forze deboli e non covalenti come le forze van der Waals, le interazioni dipolo-dipolo e l'incollaggio dell'idrogeno. Queste forze sono generalmente reversibili e hanno energia di attivazione bassa. L'entalpia dell'adsorbimento è relativamente piccola, in genere nell'intervallo di 5–40 kJ/mol, ciò significa che le molecole possono assorbire e desorbire facilmente, che è vantaggioso in termini di piccozza in termini rapidi.

Esempi di fisorpzione in cromatografia includono:

  • La ritenzione di composti nonpolari su una colonna C18 inversa-fase attraverso interazioni idrofobiche (dispersive).
  • L'assorbimento degli analiti polari sul gel di silice tramite incollaggio dell'idrogeno con gruppi di silanol di superficie in HPLC normale-fase.
  • La conservazione di composti organici volatili sulle fasi polimeriche porose in cromatografia gas-solida.

Poiché la fissorpzione è reversibile e governata da forze deboli, è altamente sensibile ai cambiamenti di temperatura, composizione di fase mobile e superficie della fase stazionaria. Aumentare la temperatura riduce tipicamente la fisirurpazione, poiché l'energia termica supera le forze attrattive deboli — una considerazione importante nello sviluppo dei metodi per gli analiti sensibili alla temperatura.

Assorbimento chimico (Chemisorption)

La chemiorpione comporta la formazione di legami chimici più forti (covalenti o ionici) tra l'analita e la fase stazionaria. L'entalpia della chemiorpazione è molto più alta, spesso maggiore di 40 kJ/mol, e il processo è solitamente irreversibile in condizioni cromatografiche normali.

Ad esempio, la cromatografia di affinità metallica immobilizzata (IMAC) si basa sulla chemiorpazione delle proteine istidina-tagged a ioni nichel o cobalto legati alla resina. Questa forte interazione selettiva permette la purificazione ad alta purezza in un unico passo.

Nello sviluppo dei metodi, è fondamentale sapere se il meccanismo di ritenzione dominante è la fissorpzione o la chemisorpazione. I metodi basati sulla fisioterapia richiedono un controllo attento della polarità e della temperatura della fase mobile per raggiungere la risoluzione. I metodi basati su chemisorption richiedono un controllo preciso del pH, della concentrazione di sale e degli agenti concorrenti per elutare gli analiti legati senza danneggiare il legante o la colonna.

Fattori che affettano l'assorbimento

L'efficienza e la selettività dell'adsorbimento in cromatografia sono influenzate da un complesso gioco di fattori, la padronanza di queste variabili è la chiave per i metodi riproducibili e ad alta risoluzione.

Superficie e struttura di poro della Fase Stazionaria

L'assorbimento è un fenomeno superficiale, quindi la superficie specifica della fase stazionaria colpisce direttamente il numero di siti di legame disponibili. Materiali ad alta superficie come silice porosa (300–500 m2/g) o perle polimeriche porose forniscono maggiori opportunità di interazione, portando a una maggiore ritenzione e capacità di carico. La distribuzione delle dimensioni dei pori conta anche: gli analiri devono essere in grado di accedere alle superfici interne dei pori.

In HPLC, particelle completamente porose (PFP) sono comuni, ma le particelle superficialmente porose (SPP, anche chiamato core-shell) offrono un compromesso—un nucleo solido con una sottile shell porosa fornisce elevata stabilità meccanica e trasferimento di massa ma meno superficie complessiva area. La scelta tra questi colpisce sia la ritenzione che la forma di picco.

Natura dell'Analita

Le dimensioni molecolari, la forma, la polarità e i gruppi funzionali dell'analita determinano la sua affinità per la fase stazionaria. Gli analiti polari (ad esempio, alcoli, ammine, acidi carbossilici) adsorbiscono fortemente alle fasi stazionarie polari come silice o alumina multiplo nella cromatografia normale-fase.

Inoltre, la capacità di un analito di formare [ legami idrogeno-intramcolari[] può ridurre la sua interazione con la fase stazionaria, portando a una ritenzione più breve. La forma molecolare influenza anche come bene l'analita si inserisce nei siti di legame – le molecole planari possono imballare più strettamente di quelli ingombranti, che interessano la selettività.

Composizione e pH della fase mobile

La fase mobile compete con l'analita per i siti di adsorbimento. Nella cromatografia normale-fase, aumentando la polarità della fase mobile (ad esempio, aggiungendo più metanolo o isopropanolo all'esano) compete più fortemente con l'analite per i siti polari nella fase stazionaria, riducendo la ritenzione.

Il pH è critico quando la fase stazionaria o l'analita contiene gruppi ionizzabili. Per le fasi stazionarie basate su silice, i gruppi silanoli (Si-OH) possono deprotonarsi al pH superiore al 3-4, creando siti a carico di polimeri.

Temperatura

La temperatura influenza l'assorbimento in due modi principali: colpisce l'energia cinetica delle molecole (migliorando la costante di equilibrio dell'assorbimento) e cambia la viscosità della fase mobile.Per la fisorpzione, la temperatura crescente riduce generalmente la ritenzione perché le forze van der Waals deboli sono superate più facilmente.

Le temperature elevate (40–60 °C) possono migliorare il trasferimento di massa e ridurre la backpressure, ma rischiano la degradazione termica di analiti sensibili o fasi stazionarie. In cromatografia a gas, la programmazione della temperatura è un modo di routine per modulare l'assorbimento e raggiungere la separazione dei composti con una vasta gamma di punti di ebollizione.

Tipo di carico ionico e tampone

La concentrazione e il tipo di sali nella fase mobile influenzano le interazioni elettrostatiche tra analiti caricati e siti di superficie carica. In cromatografia a scambio ion, l'aumento della concentrazione di sale (soprattutto controzioni) compete con l'analita per i siti di legame, riducendo la ritenzione di proteine e fornendo un mezzo per l'eluzione di gradiente.

Per le separazioni inversate-fase dei composti ionizzabili, l'aggiunta di un buffer per controllare il pH e la forza ionica è pratica standard. Ad esempio, l'acido formico 0,1% o il formato di ammonio di 10 mM è comunemente usato. Tuttavia, la cura deve essere presa perché alcuni buffer (ad esempio, fosfato) possono precipitare con solventi organici e buffer non volatili possono foul spettrometri di massa.

Implicazioni per lo sviluppo dei metodi

Comprendere il meccanismo e i fattori di assorbimento trasforma lo sviluppo dei metodi da un esercizio di prova e di error in un processo di ottimizzazione razionale.

Selezione della fase stazionaria appropriata

Se il meccanismo di ritenzione dominante è la fissorpzione attraverso interazioni idrofobiche, è opportuno una colonna C18 o C8 inversa. Per i composti polari che sono scarsamente conservati su inverso-fase, considerare il ciano (CN), l'ammino (NH2), o le fasi di diol che offrono adsorbimento polare moderato. Se si desidera che l'amisorption sia necessario per catturare una specifica affinità.

Nelle cromatografie normali, le colonne di silice o di alumina sono scelte classiche, ma le alternative moderne come silice nudo (Tipo B, elevata purezza) offrono una migliore riproducibilità. Le fasi stazionarie ibride (ad esempio, silice etilene-ponte) estendono la gamma di pH e riducono l'attività silanolica, che possono semplificare lo sviluppo dei metodi per i composti di base.

Ottimizzazione della composizione di fase mobile

Per la fase inversa, inizia con un gradiente di acqua/acetonitrile (o metanolo) e regola il primo e l'ultimo % organico per ottenere fattori di ritenzione (k) tra 1 e 10. Se l'analita è estremamente polare, considerare l'utilizzo di un alto contenuto acquoso (ad esempio, 95% di acqua) o aggiungere una piccola quantità di modificatore di fase organico per ridurre l'aquenziatore.

Per la fase normale, avviare con un solvente non polare come estano o eptano e aumentare il modificatore polare (isopropanolo, acetato di etilico) per elutare gli analiti sempre polari. L'indice di polarità [] dei solventi fornisce una guida quantitativa.

Controllo del pH e del Buffer

Per i composti ionizzabili, impostare il pH di fase mobile almeno 2 unità lontano dall'analita pKa per mantenerlo completamente in una forma ionica (sia neutro per la fase inversa o carica per lo scambio ionico).

Ottimizzazione della temperatura

Eseguire una funzione di scouting della temperatura (ad esempio, 30 °C, 40 °C, 50 °C) per osservare l'effetto sulla ritenzione e sulla forma di picco. Una diminuzione della ritenzione con temperatura conferma un meccanismo di fisorpzione-dominante. Se la temperatura ha poco effetto o aumenta la ritenzione (rara), chemisorption può essere coinvolta.

Considerazioni avanzate: Isotherms di assorbimento e forma di picco

Il rapporto tra la concentrazione di un analito nella fase mobile e la sua concentrazione sulla fase stazionaria è descritto da un [ isotermo []. La forma dell'isotermia è vitale per predire i profili di picco ed evitare il sovraccarico.

I modelli isotermici più comuni in cromatografia sono:

  • L'isotermia di Langmuir:] Assume l'adsorbimento monostrato su una superficie omogenea con un numero finito di siti identici. Questo modello si adatta a molte separazioni inversate-fase e normali-fase a concentrazioni a basso-moderato.
  • L'isotermico del fiore:[] Descrive l'assorbimento multistrato su superfici eterogenee. Spesso viene utilizzato per materiali porosi o quando si verificano più tipi di interazione. Il comportamento del tipo di freundlich può causare picchi di coda come l'analita si lega a siti più forti prima e si eluisce solo dopo che questi siti sono saturati.
  • BET (Brunauer–Emmett–Teller) isotermia:[ Applicabile ad assorbimento gas-solido ma talvolta rilevante nella cromatografia liquida quando la fase mobile fortemente si adoperi alla fase stazionaria, creando più strati.

L'asimmetria di picco (coda o fronting) è spesso una manifestazione diretta di isotermi non lineari. Ad esempio, un severo pedinamento può indicare che la fase stazionaria ha un piccolo numero di siti di adsorbimento ad alta energia (ad esempio, metalli traccia o silanoli attivi) che legano l'analita più fortemente del sito medio.

L'efficienza della colonna, espressa come numero di piastre teoriche (N), è influenzata anche dalla cinetica dell'adsorbimento. Lenti percentuali di adsorbimento-deorpzione (resistenza di trasferimento di massa) allargano i picchi. Le piccole dimensioni delle particelle e i tassi di flusso più veloci migliorano il trasferimento di massa, ma solo fino alla velocità lineare ottimale.

Studi di casi in sviluppo dei metodi

Esempio 1: Separare tre antiossidanti polari su una colonna di silice normale-fase.
Condizioni iniziali (estano/acetato etilico 80:20) ha dato scarsa risoluzione e coda pesante.

Esempio 2: Purificare una proteina ricombinante istantaneo usando IMAC.
] Una colonna Ni-NTA era bilanciata con buffer di legame (20 mM fosfato, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolo, pH 7.4).

Conclusioni

I risultati di analisi non sono un processo monolitico; comprende uno spettro di interazioni da debole, reversibile van der Waals forze di forte, selettivo legame covalente. In cromatografia, la capacità di riconoscere quale tipo di adsorbimento governa la ritenzione di pesopositivi - e di manipolare i fattori che lo influenzano - separa lo sviluppo del metodo dalla fortuna dallo sviluppo del metodo con il design.

Risorse esterne per ulteriori letture: