Lo sviluppo degli organi donatori universali è stato un obiettivo di lunga data nella medicina di trapianto, dove gli ostacoli primari sono il rifiuto del sistema immunitario e la carenza cronica di organi compatibili. Il trapianto tradizionale si basa sull'accoppiamento del donatore e del destinatario per gli antigeni del leucocito umano (HLA), ma anche con le partite ravvicinate, l'immunosuppressione permanente è necessaria per prevenire il rifiuto.

Comprensione della tecnologia CRISPR

CRISPR è uno strumento di gene-editing derivato da un sistema di difesa batterica naturale. Si compone di due componenti principali: un RNA guida che dirige il sistema a una sequenza specifica del DNA, e una proteina Cas (spesso Cas) che agisce come forbici molecolari per tagliare il DNA in quella posizione precisa. Una volta tagliato, i meccanismi naturali di riparazione della cellula possono essere trapiantati per interrompere un gene (knockout) o inserire una nuova sequenza accelerata.

I ricercatori possono ora progettare il genoma di un embrione di maiale per mancanza di geni multipli che innescano le risposte immunitarie umane, e queste modifiche sono ermetiche, consentendo la creazione di greggi di maiale modificati per la raccolta di organi.

Perché i maiali? Il modello animale preferito

I pig sono considerati la fonte più adatta per lo xenotrapianto a causa di similitudini anatomiche e fisiologiche agli esseri umani, così come la loro rapida allevamento e scalabilità.

Generi chiave mirati per organi donatori universali

Alfa-1,3-Galactosyltransferase (GGTA1)

Il gene GGTA1 codifica un enzima che attacca gli zuccheri alfa-gal alle superfici cellulari. Eliminare GGTA1 elimina l'obiettivo primario degli anticorpi preesistenti umani. Questa modifica è stata un risultato di riferimento ed è ora standard nei modelli di suini geneticamente progettati per la xenotrapiantazione. GGTA1-knockout suini

Idrossilasi acida monofosfato-N-acetilneuraminica (CMAH)

CMAH è responsabile della produzione di uno zucchero chiamato Neu5Gc, un altro xenoantigeno che gli esseri umani non hanno. Gli esseri umani hanno diffuso anticorpi anti-Neu5Gc a causa dell'esposizione alimentare, così facendo fuori CMAH riduce ulteriormente il riconoscimento immunitario. Molti ceppi di maiali moderni sono a doppio giro per GGTA1 e CMAH.

Beta-1,4-N-Acetylgalactosaminyltransferase 2 (B4GALNT2)

Il gene B4GALNT2 aggiunge un'altra struttura di carboidrati (Sda]]) che è anche immunogenico negli esseri umani. I suini triplo-knockout privi di GGTA1, CMAH e B4GALNT2 sono ora in fase di sviluppo per coprire i principali xenoantigeni.

Leukocyte Antigen (SLA) Classe I e Classe II

Oltre agli antigeni di carboidrati, il principale complesso di istocompatibilità del maiale (MHC) – noto come SLA – è un obiettivo importante per il rifiuto cellulare. Le cellule di T umano possono riconoscere le molecole di SLA e montare un attacco immunitario. CRISPR può essere utilizzato per eliminare i geni della classe I e/o della classe II, rimuovendo efficacemente gli obiettivi primari per il rifiuto immunitario di T cell-mediate.

Modifiche aggiuntive umane e compatibili

Per disfarsi ulteriormente della risposta immunitaria, i ricercatori stanno inserendo i transgeni umani nel genoma del maiale. Ad esempio, l'inserimento di proteine di regolazione del complemento umano (CD46, CD55, CD59) aiuta a proteggere le cellule del maiali dalla cascata di complemento umano.

Un elenco completo dei geni che sono stati presi di mira in xenotrapianto può essere trovato nel review da Hryhorowicz et al. (2019)] pubblicato in Frontiers in Immunology.

Ricerca e progresso attuali

Il suo risultato è stato fatto negli ultimi cinque anni, culminando nel primo trapianto sperimentale di un cuore di maiale geneticamente modificato in un paziente vivente nel gennaio 2022 presso l'Università del Maryland Medical Center. Il porco ha avuto 10 modifiche genetiche: tre tossaggi per rimuovere i principali antigeni di carboidrati (GGTA1, CMAH, B4GALNT2) e sei inserimenti di transgene umani (CD46, CD55

In parallelo, i ricercatori di varie istituzioni hanno raggiunto la sopravvivenza a lungo termine dei reni suini in primati non umani utilizzando combinazioni di modifiche genetiche e protocolli immunosoppressivi. Ad esempio, un team del Massachusetts General Hospital ha riferito la sopravvivenza dei reni suini con singoli donatori GGTA1 più proteine di complemento umano di controllo per oltre un anno in baboons, anche se con intensivoci immunosuppression.

Al di fuori della xenotrapiantazione, CRISPR è anche in fase di esplorazione per modificare gli organi umani. Ad esempio, i sistemi di perfusione ex vivo potrebbero consentire agli organi umani donati di essere gene-edited per rimuovere o modificare i geni HLA, rendendoli adatti ai destinatari indipendentemente dal malessere HLA—una strategia nota come trapianto di organi umani di disponibilità.

Sfide per il superamento

Reiezione immunitaria oltre i barri di Xenogenic

Anche con un'ampia modifica genetica, il sistema immunitario è complesso e ridondante. Rifiuto intermedio, risposte a cellule T e immunità innata tutte le sfide attuali. Attualmente, anche gli organi suini più fortemente modificati richiedono ancora immunosoppressione significativa nei destinatari, sollevando preoccupazioni sulla sicurezza a lungo termine e sul rischio di infezione. L'obiettivo è quello di creare organi che richiedono una minima o nessuna immunosoppressione, ma questo non è ancora stato raggiunto.

Rischio di infezioni zoonotiche

I virus portuali dei pig che possono infettare le cellule umane, in particolare i retrovirus endogeni porcine (PERVs), integrati nel genoma dei suini e non possono essere rimossi dall'allevamento convenzionale.

Sicurezza e stabilità delle modifiche multiple di Gene

Modificare più geni nella stessa cella aumenta il rischio di mutazioni off-target, riarrangiamenti cromosomici, o effetti non voluti su-target. La salute a lungo termine dei suini che trasportano molte modifiche è anche una preoccupazione - alcune modifiche potrebbero compromettere la normale funzione dell'organo o causare anomalie di sviluppo.

Etio e regolazione

L'uso di Xenotransplantation con animali geneticamente modificati solleva preoccupazioni etiche sul benessere degli animali, la modifica dei genoma degli animali, e il potenziale per conseguenze ecologiche non volute se gli animali dovessero sfuggire. L'etica di utilizzare soggetti umani per le prove iniziali, soprattutto quando i trattamenti convenzionali sono disponibili (ad esempio, dialisi per il fallimento dei reni), sono anche discussi.

Considerazioni etiche e di sicurezza

Il paesaggio etico per gli organi donatori universali a cura di CRISPR è multiforme: da un lato, il potenziale di salvare migliaia di vite ogni anno è immenso: la lista d'attesa per gli organi degli Stati Uniti comprende oltre 100.000 individui, e molti muoiono prima di ricevere un trapianto.

Per quanto riguarda la sicurezza, la preoccupazione principale è l'emergere di una malattia nuova da suino a umano. I PERV sono il rischio più studiato, ma altri patogeni suini (ad esempio, porcine cytomegalovirus, porcine linfotropic herpesvirus) possono anche infettare le cellule umane.

Organizzazione Mondiale della Sanità (WHO) ha stabilito un programma dedicato sulla xenotrapiantazione[[[]] per fornire orientamenti internazionali e coordinare gli approcci normativi, sottolineando principi etici e standard di sicurezza.

Prospettive e conclusioni future

Il percorso verso gli organi donatori universali è ancora nelle sue prime fasi, ma la convergenza della tecnologia CRISPR, progressi nell'immunologia, e una comprensione più profonda delle barriere di xenotrapianto offrono un ottimismo senza precedenti.

Inoltre, le tecnologie sviluppate per la xenotrapiantazione possono anche tornare a rifornirsi di allotransplantation (umano-umano). Ad esempio, la modifica CRISPR degli organi umani durante la perfusione ex vivo potrebbe "universalizzare" il tipo di sangue o lo stato HLA, rendendo qualsiasi organo donato adatto a qualsiasi destinatario, che potrebbe effettivamente porre fine al problema della carenza di organi a causa di incompatibilità immunologica.

In conclusione, la tecnologia CRISPR sta trasformando il paesaggio della medicina di trapianto, consentendo la creazione di organi animali geneticamente modificati che possono evadere il sistema immunitario umano. Mentre gli ostacoli relativi alla sicurezza, all'efficacia e all'etica rimangono, i primi trapianti di suini-umani di successo hanno già dimostrato il potenziale di questo approccio.