Cromatografia come strumento per la scoperta di Metabolomics e Biomarker

Principi di cromatografia

La cromografia separa le molecole in base alla loro distribuzione differenziale tra una fase stazionaria e una fase mobile. La fase stazionaria può essere un solido o un liquido rivestito su un solido supporto, mentre la fase mobile è un liquido o un gas che trasporta il campione attraverso il sistema.

Diversi parametri influenzano l'efficienza della separazione: dimensioni del column, dimensione delle particelle, ] flusso di flusso, e composizione della fase mobile].

Tecniche di cromatografia chiave per la metabolomica

Cromatografia a gas (GC)

Gli acidi GLT sono ideali per l'identificazione volatile e ] metaboliti. I campioni sono vaporizzati e passati attraverso una colonna rivestita di una fase stazionaria liquida, con un gas inerte (ad esempio, elio) come la fase mobile.

Cromatografia liquida (LC)

LLT (L) non-volatile] e si aggiungono i composti della labile. Molti studi di metabolomica usano le molecole di semi-fase (RP) LC con colonne C18 per molecole non polari o polari moderatamente

Elettroforesi Capillaria (CE)

CE separa gli ioni in base al loro mobilità elettroforetica in un capillare stretto sotto un campo elettrico. È particolarmente efficace per altamente polare e efficienza elettrica] metaboliti, come fosfotidi nucleotidi, acidi organici, e CEry

Integrazione cromatografia con spettrometria di massa

Le tecniche if[6] sono la colonna portante della metabolomica. La separazione cromatografica riduce la soppressione dell'ione e consente agli spettrometri di massa di analizzare i composti singolarmente. La spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) [misure di massa accurate, Q-TOF, Orbitrap] fornisce informazioni accurate

Il flusso di lavoro Metabolomics

Preparazione del campione

I metaboliti sono rapidamente girati, quindi il metabolismo deve essere ] incollato ] immediatamente (ad esempio, i passi freddi del metanolo). I metodi di estrazione come l'estrazione del liquido bifasico (ad esempio, metanolo / cloroformio / acqua)

Separazione e rilevamento

Le condizioni cromatografiche sono ottimizzate in base alle classi di interesse metabolita. Ad esempio, una colonna C18 con un gradiente di acqua/acetonitrile e 0,1% acido formico si adatta alla maggior parte delle lipidomie. Le colonne HILIC utilizzano fasi mobili ad alto contenuto organico per i metaboliti polari. Temperatura colonna, portata e volume di iniezione sono regolate per massimizzare la capacità di picco e la riproducibilità.

Trattamento dei dati

I dati della spettrometria di massa (] sono diversi[FLT:]] e ], alignment] attraverso i campioni, e ]]] (per esempio, anno al conteggio totale o standard interno).

Approcci Metabolomici

Metabolomics non mirati

La metabolomica non mira a rilevare il maggior numero di metaboliti possibile senza alcuna conoscenza preventiva. La profilazione globale genera ipotesi sulle perturbazioni metaboliche. La cromatografia deve essere larga o più colonne utilizzate. Ad esempio, un approccio a doppia colonna (RP-LC e HILIC) copre sia i composti polari che quelli non polari.

Metabolomics mirati

La metabolomica mirata si concentra sulla quantificazione di un insieme predefinito di metaboliti, spesso biomarcatori. Stable isotopo-labeled standard interni[] consentono una quantificazione assoluta. MRM su strumenti a triplo quadrupolo fornisce elevata sensibilità e specificità. La cromatografia è ottimizzata per i composti target, spesso con tempi di esecuzione più brevi per un elevato rendimento.

Ruolo della cromatografia in Biomarker Discovery

Fase di scoperta

Nella scoperta dei biomarcatori, la cromatografia separa i liquidi biologici complessi (plasma, urina, estratti di tessuto) per rivelare i metaboliti correlati alla malattia. Ad esempio, [ aminoacidi a catena brancata (BCAAs)[]] sono stati identificati come marcatori iniziali della resistenza all'insulina utilizzando LC-MS.

Fase di convalida

La cromatografia fornisce la [ reproducibilità[[]] necessaria per la convalida. La stabilità del tempo di conservazione e la precisione di massa garantiscono un'identificazione coerente. ] La convalida del metano]]] include la valutazione della linearità, dei limiti di rilevamento, della precisione e dell'accuratezza clinica.

Traduzione clinica

Il passaggio dalla ricerca alla diagnostica clinica richiede metodi di alto rendimento robusti. I test basati sulla cromatografia per i biomarcatori come homocysteine (LC-MS/MS) e i metaboliti di vitamina D] (LC-MS) sono già utilizzati nei laboratori clinici.

Studi di casi in Malattia Biomarkers

Metabolomics del cancro

Le cellule tumorali presentano un metabolismo alterato: l'effetto Warburg (glicolisi aerobica). La cromatografia ha permesso la scoperta di un elevato lattato, alterato gli intermedi del ciclo TCA e cambiamenti del metabolismo dei nucleotidi.

Diabete e Sindrome Metabolica

La sindrome metabolica comporta la disregulation di lipidi, aminoacidi e marcatori di glucosio. Gli studi di cromatografia hanno identificato BCAAs[], ] aminoacidi aromatici] (tirosina, fenillalanina) e acrilicocarnitines[