Comprendere le conchiglie di idratazione in Biomolecolare cristallizzazione

La cristallizzazione delle molecole biologiche come proteine, acidi nucleici e grandi complessi macromolecolari rimane uno dei passi più esigenti nella biologia strutturale. L'ottenimento di cristalli di alta diffrazione è spesso il tasso-limitante collo di bottiglia nella determinazione delle strutture di risoluzione atomica. Mentre molti fattori influenzano le condizioni di cristallizzazione, compreso il pH, la forza ionica, la temperatura e la concentrazione precipitante, il ruolo della bio-mole determinante di idro-mole

L'acqua non è solo un solvente passivo, partecipa attivamente alle dinamiche conformazionali, alla stabilità e alle interazioni intermolecolari delle macromolecole biologiche. La conchiglia di idratazione, uno strato strutturato di molecole d'acqua all'interfaccia biomolecole-solvente, media ogni contatto che una molecola fa con il suo ambiente.

Cosa sono le Shell di Idratazione?

Una conchiglia di idratazione, chiamata anche strato di solvazione o acqua di idratazione, è l'insieme di molecole d'acqua che circondano una molecola soluta in soluzione acquosa. Per le macromolecole biologiche, questa conchiglia si estende tipicamente da una a tre molecole d'acqua spesse, corrispondenti ad una distanza di circa 3 a 10 Å dal campo molecolare.

Tipi di acqua di idratazione

L'acqua di idratazione può essere classificata in popolazioni distinte basate sul suo grado di ordinazione e tempo di residenza:

  • Acqua calda:[] Le molecole d'acqua che formano legami idrogeno stabili e di lunga durata con gruppi polari o carichi sulla biomolecola. Queste acque spesso appaiono con elevata occupazione nelle mappe a densità elettroni cristalline e possono essere critiche per l'integrità strutturale.
  • Acqua di superficie dell'orecchio:[] Le molecole d'acqua all'interno dei primi e dei secondi strati di idratazione che sono stati ordinati in modo transitorio ma scambiano con acqua di massa su scale temporali di picosecondo a nanosecondo.
  • Acqua idropobica:[ Acqua vicino a macchie di superficie nonpolare che formano gabbie simili a clathrate per ridurre al minimo il contatto con gruppi idrofobici. Questa acqua è entropalmente sfavorevole e svolge un ruolo chiave nella guida del collasso idrofobico e dell'associazione intermo-lecolare.

La struttura esatta e la dinamica della conchiglia di idratazione dipendono dal carattere chimico della superficie molecolare, dalla forza ionica della soluzione, dalla presenza di co-solventi o agenti precipitanti. In condizioni di cristallizzazione, questi fattori vengono manipolati deliberatamente per modulare le proprietà della conchiglia di idratazione e incoraggiare la formazione di reticoli ordinati.

La chimica fisica della formazione di Hydration Shell

Le conchiglie di idratazione si formano perché le molecole d'acqua sono dipolari e altamente polarizzabili. Quando un gruppo carico o polare su una biomolecola è esposto all'acqua, le cariche parziali sulle molecole d'acqua orienti per creare interazioni elettrostatiche energicamente favorevoli. Per un gruppo carbossilato tipico, ad esempio, due o quattro molecole d'acqua possono formare legami diretti di idrogeno, con altre acque recluse in un secondo guscio attraverso il legame con l'acqua.

La termodinamica della formazione delle conchiglie di idratazione comporta sia componenti entalpi che entropici. Il contributo entalpico deriva dalla formazione di legami idrogeno e dalle interazioni elettrostatiche tra acqua e biomolecola, che sono generalmente favorevoli. Il contributo entropico è più complesso: ordinare molecole d'acqua in superficie riduce l'entropia di configurazione dell'acqua, che è sfavorevole.

Parametri di occhio che influenzano le proprietà della shell di idratazione includono:[

  • Densità di carica della superficie:[ La densità di carica più elevata aumenta la resistenza e la gamma di ordinazione dell'acqua.
  • Modello donatore/acceptore di idrogeno-bond:[ La compatibilità geometrica tra i gruppi superficiali e la rete di acqua idrogeno-bond determina la struttura dell'acqua locale.
  • Ionicità e identità ioniche:[] Ioni in soluzione competono con acqua per i siti di legame e possono interrompere o rafforzare le conchiglie di idratazione a seconda della loro posizione nella serie Hofmeister.
  • Temperatura:[[] Le temperature più elevate aumentano il movimento termico e riducono l'ordine dell'acqua idratante, che può influenzare la nucleazione e la crescita di cristallo.
  • Co-solventi e precipitanti:[ Glicole in polietilene, solfato di ammonio e altri cristalli comuni alterano il potenziale chimico dell'acqua e modificano la stabilità delle conchiglie di idratazione.

Per una discussione approfondita delle dinamiche dell'acqua nelle interfacce biomolecolari, vedere Laage et al., "Water Dynamics in the Hydration Shells of Biomolecules," Chemical Reviews (2017).

Il ruolo delle conchiglie di idratazione in cristallizzazione

La cristallizzazione delle molecole biologiche è una transizione di fase da uno stato disordinato e solvato in soluzione a un reticolo ordinario e periodico. La conchiglia di idratazione influenza ogni fase di questo processo: formazione del cluster di prenucleazione, nucleazione, crescita di cristallo e la qualità finale del reticolo di cristallo.

Cluster di pre-Nucleazione e concentrazione locale

Prima che un nucleo di cristallo stabile si forma, le molecole in soluzione devono incontrarsi e formare cluster transitori. La conchiglia di idratazione agisce come una barriera fisica ed energetica all'associazione. Quando due molecole si avvicinano, le loro conchiglie di idratazione devono essere parzialmente spostate per consentire il contatto diretto intermale. L'energia necessaria per desolvare le superfici di interazione è una componente importante della barriera di attivazione per la nucleazione.

Nelle soluzioni concentrate, in particolare quelle contenenti precipitanti che riducono l'attività dell'acqua, le conchiglie di idratazione delle molecole adiacenti iniziano a sovrapporre e a distorcere, creando regioni di densità di acqua ridotta e alterate forme di accoppiamento dell'idrogeno che possono promuovere la formazione di cluster prenucleati.

Ginecosi della Nucleazione

La teoria della nucleazione classica descrive la formazione di un nucleo di cristallo come un equilibrio tra la favorevole energia libera di formare contatti intermolecolari nel reticolo e l'energia libera sfavorevole di creare una nuova interfaccia solido-liquido.

I vettori che modulano la nucleazione attraverso gli effetti delle conchiglie di idratazione:

  • Tipo e concentrazione di precipitazione:[[] Alte concentrazioni di solfato di ammonio o PEG riducono la disponibilità di acqua e parzialmente disidratano la superficie molecolare, facilitando la nucleazione.
  • pH e forza ionica:[] Regolazione del pH altera lo stato di protonazione dei residui superficiali, modificando la distribuzione della carica e il modello di idratazione della molecola.
  • Additivi come glicerolo o DMSO:[ Questi co-solventi alterano la struttura dell'acqua e possono stabilizzare o destabilizzare le conchiglie di idratazione a seconda della concentrazione.
  • Controllo temperatura:[[] Le temperature più basse aumentano l'ordine dell'acqua e possono rallentare la nucleazione, mentre le temperature più elevate promuovono la disidratazione e la nucleazione più rapida.
  • Cfr.:[] L'introduzione di semi di cristallo preformati fornisce una superficie in cui la perturbazione della shell di idratazione è già favorevole, bypassando la necessità di nucleazione de novo.

Interazioni intermolecolari Mediate da Hydration Water

Le molecole di acqua all'interfaccia tra le molecole in un reticolo di cristallo non sono semplicemente spettatori passivi. In molte strutture di cristallo, le molecole di acqua ben ordinate ponte le molecole adiacenti attraverso i legami di idrogeno, servendo efficacemente come parte del reticolo. Queste acque di collegamento contribuiscono alla stabilità del cristallo e influenzano l'orientamento preciso delle molecole nella cellula dell'unità.

Il concetto di "contatti intermedi d'acqua" è ben stabilito nella cristallografia proteica. Gli studi hanno dimostrato che fino al 30-50% dei contatti intermolecolari nei cristalli proteici comportano almeno una molecola d'acqua. Queste interazioni mediate dall'acqua sono spesso più flessibili dei contatti diretti proteici, permettendo al reticolo di accogliere variazioni conformali minori mantenendo l'ordine generale.

Impatto sulla qualità del cristallo

La qualità di un cristallo per la diffrazione a raggi X dipende dal grado di ordine a lungo raggio, dalla mosaicità e dal contenuto solvente del cristallo.

Ordine e Mosaico

Una conchiglia di idratazione ben ordinata, compatibile con il reticolo di cristallo, favorisce una bassa mosaicità e una risoluzione di diffrazione elevata. Quando la conchiglia di idratazione viene disturbata o eterogenea, le molecole del cristallo possono adottare orientamenti o conformazioni leggermente differenti, aumentando la mosaicità e riducendo il limite di risoluzione dei dati di diffrazione.

Risolvere la qualità dei contenuti e delle diffrazioni

La distribuzione di questo solvente tra le conchiglie di idratazione ordinate e le regioni di massa disordinate determina la struttura complessiva del solvente nel cristallo. I cristalli con una elevata percentuale di solventi disordinati tendono ad avere una maggiore mosaicità e una minore qualità di diffrazione. Capire come manipolare le condizioni di cristallizzazione per ridurre al minimo le regioni di solvente disordinato è un'area attiva di ricerca.

Strategie pratiche per migliorare la qualità del cristallo tramite il controllo dell'idratazione

  • Ottimizzare la concentrazione precipitante:[] L'ottimizzazione della concentrazione precipitante può produrre cristalli con contenuto solvente inferiore e un ordine migliore.
  • Utilizza gli additivi che imitano l'idratazione naturale:[ Alcuni osmoliti come trealosi o gusci stabilizzanti dell'idratazione della prolina e possono migliorare la qualità del cristallo.
  • Controlla disidratazione postcristallizzazione:[ Disidratazione controllata dei cristalli, esponendoli all'umidità controllata può migliorare la risoluzione diffrazione rimuovendo l'acqua disordinata dal reticolo.
  • Ottimizzazione di raffreddamento:[ La scelta del crioprotettore influisce sulla transizione di vetro dell'acqua nel cristallo e può impedire la formazione di cristalli di ghiaccio che danneggiano il reticolo.

Per una revisione completa delle strategie di ottimizzazione della cristallizzazione, vedere McPherson & Gavira, "Introduzione alla cristallizzazione delle proteine", Acta Crystallographica Sezione F (2015).

Implicazioni per Biologia Strutturale e Progettazione Droga

La capacità di ottenere cristalli di alta qualità delle macromolecole biologiche è fondamentale per la biologia strutturale. La cristallizzazione a raggi X rimane il metodo dominante per determinare le strutture di risoluzione atomica, e queste strutture sostengono la progettazione razionale della droga, l'ingegneria degli enzimi e gli studi meccanicistici della funzione molecolare.

Analisi della Shell di scoperta e di idratazione della droga

In struttura-based di progettazione di farmaci, le molecole di acqua nel sito vincolante sono di particolare interesse. Lo spostamento di acqua ordinata da un'interfaccia di legame proteina-ligand può contribuire in modo significativo a legare energia libera. Capire la struttura della shell di idratazione di una proteina di destinazione permette agli chimici medicinali di progettare i leganti che o spostano le acque specifiche con il guadagno entropico favorevole o formano legami idrogeno-mediati con la proteina.

Metodi computazionali come WaterMap, 3D-RISM e calcoli di dinamica molecolare sono ora abitualmente utilizzati per identificare le acque dislocabili nelle strutture di cristallo proteico e prevedere le conseguenze termodinamiche dello spostamento dell'acqua. Questi strumenti si basano su modelli accurati di struttura delle conchiglie di idratazione e dinamiche derivate da dati sperimentali e simulazioni.

Proteine Membrane e Sfide di Idratazione

Membrane proteins pose a special challenge for crystallization because their hydrophobic transmembrane regions are typically stabilized by detergent micelles or lipid bilayers. The hydration shell at the detergent-protein interface is distinct from that of soluble proteins, with water molecules confined to narrow channels and interfacial regions. Innovations such as lipidic cubic phase crystallization and the use of novel detergents are designed, in part, to provide a more native-like hydration environment for the protein, improving the chances of obtaining well-ordered crystals.

Per una panoramica dei metodi di cristallizzazione delle proteine della membrana, vedi Birch et al., "Scrittatura delle proteine della membrana: tendenze attuali e prospettive future", Valutazione della natura Chimica (2021).

Tecniche per studiare le conchiglie di idratazione

L'analisi della struttura e della dinamica delle conchiglie di idratazione richiede approcci sperimentali e computazionali che possono sondare il comportamento dell'acqua a scala molecolare, e ogni tecnica fornisce informazioni complementari su diversi aspetti dell'idratazione.

Spazzola di neutroni

La diffrazione di neutroni e la dispersione di neutroni ad angolo piccolo (SANS) sono metodi potenti per studiare le conchiglie di idratazione perché i neutroni sono sensibili all'idrogeno e al deuterio. Utilizzando acqua deuterata o biomolecole selettivamente deuterate, i ricercatori possono distinguere lo spargimento dall'acqua di idratazione da quella della macromolecole.

Cristallografia a raggi X e microscopio Cryo-Electron

Le strutture a raggi X ad alta risoluzione rivelano regolarmente molecole d'acqua ordinate nelle conchiglie di idratazione, soprattutto nel primo guscio di coordinamento intorno a gruppi polari e cariche. In genere, le strutture a risoluzioni migliori di 2.0 Å possono modellare in modo affidabile le acque rilegate, mentre le strutture a bassa risoluzione possono mancare o spostarle male.

Spettroscopia di Infrared e Terahertz

La spettroscopia vibrazionale sonda le dinamiche delle molecole d'acqua attraverso le loro caratteristiche bande di assorbimento. La spettroscopia di Terahertz in particolare è sensibile ai movimenti collettivi delle molecole d'acqua nelle conchiglie di idratazione e può distinguere tra acqua di massa, acqua debole e acqua fortemente legata. Queste tecniche possono essere applicate in soluzione in condizioni cristallizzanti per monitorare i cambiamenti nell'idratazione come funzione di temperatura, concentrazione e composizione precipitante.

Simulazioni di dinamica molecolare

Le simulazioni di computer offrono una visione atomistica e risolta del tempo delle dinamiche delle conchiglie di idratazione non accessibili sperimentalmente. Le simulazioni di dinamiche molecolari (MD) possono calcolare i tempi di residenza, le vite di idrogeno-bond e le distribuzioni spaziali dell'acqua intorno alle biomolecole con alta precisione.

Per una dettagliata revisione metodologica, vedi Perticaroli et al., "Hydration and dynamics of biologico macromolecoles," Rassegna annuale della chimica fisica (2020).

Istruzioni e domande aperte

Nonostante decenni di ricerca, molti aspetti del comportamento delle conchiglie di idratazione durante la cristallizzazione rimangono incompleti.

  • Come si evolvono le conchiglie di idratazione durante le prime fasi della nucleazione?[ L'osservazione sperimentale diretta della struttura delle conchiglie di idratazione nei cluster di prenucleazione è estremamente impegnativa e richiede nuovi metodi spettroscopici o di spargimento.
  • Le proprietà della shell di idratazione possono essere utilizzate per prevedere le condizioni di cristallizzazione? Modelli di apprendimento automatico che incorporano i descriptors delle conchiglie di idratazione sono in fase di sviluppo per prevedere il successo di cristallizzazione dalle proprietà della superficie proteica.
  • Qual è il ruolo dell'acqua nella formazione di diversi polimorfi di cristallo? Diverse forme di cristallo della stessa molecola hanno spesso diverse strutture di conchiglia di idratazione all'interfaccia cristallina, ma il rapporto tra idratazione e selezione polimorfica non è ben compreso.
  • Come le conchiglie di idratazione influenzano il comportamento delle proteine intrinsecamente disordinate? Queste proteine non hanno una struttura terziaria stabile e sono altamente solvate, rendendo il loro comportamento di cristallizzazione fondamentalmente diverso da quello delle proteine piegate.

Conclusioni

Le gusci di idratazione sono molto più di uno strato solvente passivo che circonda le molecole biologiche. Sono un partecipante attivo e dinamico nel processo di cristallizzazione, influenzando la stabilità molecolare, la cinetica delle nucleazioni, le interazioni intermolecolari e la qualità finale del reticolo di cristallo. Una profonda comprensione della fisica delle conchiglie di idratazione e della chimica consente ai ricercatori di progettare strategie di cristallizzazione più razionali, ottenere i dati di diffrazione sperimentali di sviluppo delle strutture di sviluppo.

Per coloro che cercano una guida pratica alla cristallizzazione biomolecolare che incorpora concetti di idratazione, l'Unione Internazionale di Cristallografia offre risorse educative e linee guida best-practice[] che sono regolarmente aggiornati dalla comunità.