Introduzione al HPLC inversa e al ruolo della fase mobile

La cromatografia liquida ad alta intensità di fase (RP-HPLC) rimane una delle tecniche di separazione più versatili e ampiamente adottate nei laboratori di analisi farmaceutica, ambientale, biochimica e alimentare. Il metodo si basa su una fase stazionaria non polare, ossia C18, C8, o silice fenile-bonded, e una fase mobile polare acologica più lunga.

Mentre la chimica stazionaria e le dimensioni delle colonne sono fissate durante lo sviluppo dei metodi, la composizione della fase mobile offre la massima flessibilità per la messa a punto di una separazione.Le piccole regolazioni in tipo solvente organico, rapporto organico-acqua, pH tampone, resistenza ionica, o l'aggiunta di modificatori possono alterare profondamente i tempi di conservazione, la spaziatura di picco e la risoluzione generale.

Basi teorica della risoluzione in RP-HPLC

La risoluzione (Rs[]]) tra due picchi adiacenti è definita dall'equazione fondamentale:

R]][] = (√N/4) × (α – 1) × (k'/(1 + k')

dove N è l'efficienza della colonna (numero di targa), α è il fattore di selettività tra i due analiti, e k' è il fattore di ritenzione (fattore di capacità) del picco di eluzione successiva.

  • Efficienza (N): Mentre principalmente determinato dalla qualità della colonna e dalla portata, la viscosità della fase mobile e la concentrazione additiva possono influenzare il trasferimento di massa e quindi l'altezza della piastra.
  • Selettività (α): Il rapporto tra fattori di ritenzione per due composti è altamente sensibile alla composizione della fase mobile, in particolare il tipo di solvente organico e pH.
  • Fattore di conservazione (k'): La percentuale di solvente organico controlla la forza di eluzione generale. Un contenuto organico più elevato riduce k' per tutti gli analiti, comprimendo il cromoatogramma.

Una comprensione approfondita di come ogni componente della fase mobile influisce su questi parametri consente all'analista di ottimizzare sistematicamente le separazioni piuttosto che affidarsi a supposizioni.

Componenti chiave della fase mobile

Buffer acqua e acqua

L'acqua è il solvente debole in RP-HPLC. L'acqua ad alta purezza (Tipo I, resistenze ≥ 18.2 MΩ·cm) è obbligatoria per evitare rumore di base, picchi di fantasma e contaminazione della colonna. Per gli analiti ionizzabili, i buffer sono aggiunti per controllare il pH. I buffer comuni includono fosfato, acetato, formate e rilevatore di concentrazione trifluoroacetica 10 MFAM

Solventi organici

I tre più comuni modificatori organici sono acetonitrile (ACN), metanolo (MeOH), e tetraidrofuran (THF).

  • Acetonitrile:[] Bassa viscosità, elevata resistenza eluotropica, basso taglio UV (190 nm). Eccellente per le separazioni che richiedono alta efficienza e analisi veloce.
  • Metanolo:[] Viscosità più elevata di ACN, che può aumentare la pressione posteriore. Fornisce una selettività diversa, soprattutto per i composti polari. Spesso utilizzato quando ACN non riesce a risolvere coppie critiche.
  • THF:[] Ancora più forte eluente, ma il suo uso è limitato da un'elevata assorbibilità UV (cutoff ~212 nm) e da potenziali problemi di stabilità.

Le miscele di acqua ternary, ACN e MeOH sono talvolta utilizzate per la selettività fine del suono, anche se le miscele binarie sono più comuni per la robustezza.

Additivi e Reagenti Ion-Pairing

Per gli analiti caricati (ad esempio, gli acidi carbossilici, le ammine, i peptidi), il pH di fase mobile deve essere controllato per garantire stati di ionizzazione coerenti. I reagenti di parabolaggio ion come l'acido eptafluorobutirrico (HFBA) o il fosfato di massa trietilico possono essere aggiunti per aumentare la ritenzione di specie ioniche, formando coppie di fase ioni neutre che possono partizione nei segnali di colonna stazionari.

Effetto del Solvent Organico Tipo e Percentuale

Il modo più semplice per regolare la ritenzione è quello di cambiare la percentuale di solvente organico. Nell'eluzione isocratica viene utilizzata una composizione costante durante la corsa. In eluzione di gradiente, la percentuale organica aumenta nel tempo, permettendo la separazione di analiti con una vasta gamma di idrofobicità in un unico ciclo.

Ottimizzazione isocratica

Per un determinato solvente, la riduzione della percentuale organica aumenta la ritenzione (più alta k') e migliora generalmente la risoluzione, a condizione che il tempo di analisi rimanga accettabile. Una regola del pollice: il k' del primo picco dovrebbe essere tra 1 e 5, e l'ultimo picco tra 5 e 20. Se i valori k' sono troppo bassi, i picchi eluti vicino al volume vuoto; se troppo alto, il tempo di analisi diventa eccessivo e l'allargamento di picco si verifica.

Tuttavia, aumentare la ritenzione aumenta anche il rischio di coda di picco e di allargamento della banda a causa di lento trasferimento di massa nella fase stazionaria. La percentuale organica ottimale è spesso trovata con l'esecuzione di un gradiente scouting (ad esempio, 5% a 95% B oltre 20 min) e quindi selezionando una composizione isocratica che centri la regione di interesse.

Eluzione gradita

I metodi di gradiente sono essenziali quando i campioni contengono analiti con una vasta gamma di polarità. Il pendio di pendenza (cambiamento in %B al minuto) influisce significativamente sulla risoluzione. I gradienti di steeper comprimeno i picchi ma riducono la risoluzione generale; i gradienti di scalo aumentano la risoluzione al costo dei tempi di funzionamento più lunghi.

Cambiamenti di selettività tra i solventi

Il passaggio dall'acetonitrile al metanolo (o utilizzando una miscela) può alterare l'ordine di eluzione di composti strettamente correlati. Ciò avviene perché le proprietà di solvazione della fase mobile influenzano le interazioni di fase analite-stazionerie in modo diverso per ogni composto. Quando due picchi co-elute in ACN, un primo passo comune è quello di provare MeOH con una forza di eluzione equivalente (ad.

Ruolo di pH e Selezione Buffer

Per composti contenenti gruppi funzionali ionizzabili (acidi, basi, zwitterions), il pH della porzione acquosa della fase mobile è fondamentale. La ritenzione di un analito ionizzabile cambia bruscamente intorno al suo pKa]. In generale:

  • Acidi deboli (pK[]]a 3–6):[] A basso pH (sotto pK]a]]), l'analita è neutrale e mantenuto fortemente.
  • Basi deboli (pK[]a[ 6–10]): Comportamento opposto: neutro ad alto pH, ionizzato a basso pH. Per composti di base, le separazioni sono spesso eseguite a basso pH (ad esempio, 2.5–3,5) per mantenere l'analyte protonated e migliorare la forma di picco residuo sui silano-based silano).

Per ottenere tempi di conservazione riproducibili, il pH di fase mobile deve essere tamponato entro ±0.2 unità del bersaglio. I tamponi come il fosfato (pKa2 precipita] = 7.2), l'acetato (pKa] = 4.76) e l'azoto formato (pK[FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF[4][4]

pH e risoluzione

Quando due analiti hanno valori diversi pK[a], regolare il pH può migliorare drasticamente la risoluzione cambiando lo stato di ionizzazione e quindi la ritenzione—di un composto mentre lascia l'altro relativamente invariato. Ad esempio, un acido carbossilico e un composto neutro possono co-elute a pH 7; abbassare il pH a 3 manterrà l'acido più fortemente mentre la coppia di risonanza neutrale.

Per i metodi che utilizzano il rilevamento di spettrometria di massa, sono necessari buffer volatili come l'acetato di ammonio o il formato di ammonio. I buffer non volatili (ad esempio, il fosfato) sono incompatibili con l'ionizzazione di elettrospruzzi.

Una risorsa utile per la selezione del buffer e il controllo del pH è la guida Sigma-Aldrich alla preparazione della fase mobile HPLC[.

Influenza di Ionic Strength e Ion-Pairing Agents

La forza ionica si riferisce alla concentrazione totale di ioni nella fase mobile. Aumentare la resistenza ionica (aggiungendo un sale come NaCl o aumentando la concentrazione di buffer) può influenzare la ritenzione in diversi modi:

  • Per gli analiti ionizzabili, la maggiore resistenza ionica riduce l'attrazione elettrostatica o la repulsione tra i gruppi di analiti e silanol residui nella fase stazionaria, migliorando spesso la forma di picco e riducendo la coda.
  • La forza ionica può anche influenzare il grado di solvazione di analiti, subtly alterando l'idrofobicità e la ritenzione.

In pratica, le concentrazioni di buffer tra 10 mM e 50 mM sono tipiche. Troppo poca resistenza ionica porta a scarsa forma di picco per le basi; troppo può causare precipitazioni o danni alle pompe e guarnizioni.

Cromatografia di Ion-Pair

Per gli analiti altamente polari o caricati che mostrano poca ritenzione sulle colonne standard C18, i reagenti ioni-pair sono aggiunti. Questi reagenti hanno una coda idrofobica e un gruppo di testa carica. Le adsorbi della coda alla fase stazionaria, creando una superficie di scambio pseudo-ion-effrazione. Ad esempio, l'aggiunta di tetrabutylammonium fosfate (una cationica negativa) alla fase mobile aumente la ritenzione di compostifona.

I metodi di ion-pair richiedono un equilibro accurato (spesso 10-20 volumi di colonne) e possono essere lenti a riequilibrare dopo le operazioni di gradiente. La concentrazione di ion-pair reagent varia tipicamente da 1 mM a 20 mM.

Per una guida più dettagliata sui metodi di ion-pair, vedere la Nota tecnica agilente sulla cromatografia ion-pair[.

Moduli aggiuntivi: temperatura, additivi

Mentre non rientra nella composizione della fase mobile, la temperatura della colonna interagisce fortemente con gli effetti della fase mobile. Aumentare la temperatura riduce la viscosità della fase mobile, abbassa la pressione posteriore e generalmente diminuisce la ritenzione. La temperatura può anche alterare la selettività, soprattutto per i composti con diversi contributi entropi alla ritenzione. Molti metodi moderni utilizzano forni a colonna controllati per garantire la riproducibilità.

Anche piccole quantità di additivi possono migliorare la forma di picco o attivare modalità di rilevamento specifiche:

  • L'acido trifluoroacetico (TFA)[ (0.05–0.1% v/v) è un agente comune di ion-pairing per separazioni peptide e agisce anche come un modificatore a basso pH. Tuttavia, TFA può sopprimere i segnali ESI-MS; l'acido formico è preferito per LC-MS.
  • Triethylamine (TEA)[ a basse concentrazioni (0,1% v/v) può ridurre la coda per i composti di base mascherando l'attività silanolica.
  • EDTA[]]] viene talvolta aggiunto alle fasi mobili per ingannare gli ioni metallici che potrebbero causare la coda di picco per alcuni composti sensibili al metallo.

Strategie di sviluppo del metodo per l'ottimizzazione della fase mobile

Lo sviluppo di metodi moderni segue spesso un flusso di lavoro strutturato per ridurre al minimo il processo e l'error. Un punto di partenza comune è quello di eseguire un ampio gradiente (ad esempio, 5-95% B oltre 20 min) su una colonna C18 con ACN come solvente organico.

Progettazione di esperimenti (DoE)

Per separazioni più complesse, il software DoE può esplorare contemporaneamente più variabili (ad esempio, %B, pH, temperatura, concentrazione del buffer). Un approccio tipico utilizza un design composito centrale a centro faccia o un design Box-Behnken con 15-20 run. Il modello di superficie di risposta prevede quindi condizioni ottimali e indica robustezza.

Esplorazione di colonne e solventi diversi

Se la risoluzione è insufficiente dopo l'ottimizzazione della fase mobile, il passo successivo è quello di provare una chimica di colonna diversa (ad esempio, C8, fenil, polar-embedded C18) o un solvente organico diverso.

Un approccio sistematico è descritto nella guida di sviluppo del metodo HPLC [], che fornisce modelli pratici per la valutazione e la conversione gradiente-to-isocratica.

Considerazioni pratiche e risoluzione dei problemi

Anche con un'attenta ottimizzazione della fase mobile, gli analisti possono incontrare problemi comuni:

  • Parlamento:[] Spesso causato dalle interazioni silanoli con i composti di base. Aumentare la concentrazione del buffer, pH inferiore (a 3 o inferiore), o aggiungere una base concorrente come TEA. La qualità finale della colonna conta anche.
  • Picchi separati o doppie:[] Indica equilibrazione incompleta (soprattutto dopo un gradiente), vuoto di colonna, o parziale degradazione del campione nella fase mobile.
  • Tempo di conservazione deriva:[] Di solito a causa della deriva del pH, perdita evaporativa del solvente organico, o fluttuazioni della temperatura della colonna.
  • Alta pressione:[[]] Può essere causata da fasi mobili ad alta viscosità (ad esempio, acqua alta con metanolo a basse temperature) o da precipitazioni del sale quando si mescolano tampone acquoso con un'alta percentuale di solvente organico.
  • Rumore di base o deriva:[ Spesso dalle impurità di assorbimento UV nei solventi o nei buffer.

Un'altra risorsa eccellente per la risoluzione dei problemi è la [Crawford Scientific HPLC Guida per la risoluzione dei problemi[.

Conclusioni

La composizione della fase mobile è il singolo strumento più potente per il controllo della risoluzione in HPLC inversa. Con metodo di regolazione del tipo e percentuale di solvente organico, pH tampone e resistenza ionica, e selettivamente utilizzando additivi o reagenti ion-pair, gli analisti possono raggiungere la separazione della linea di base per anche le miscele empiriche più impegnative.

I progressi nella tecnologia delle colonne, l'ottimizzazione del software e la robusta strumentazione hanno reso l'ottimizzazione delle fasi mobili più accessibili che mai. Tuttavia, i principi fondamentali rimangono invariati: attenzione attenta alla preparazione della fase mobile, al controllo del pH e alla qualità dei solventi è essenziale per ottenere separazioni riproducibili e ad alta risoluzione giorno dopo giorno.

Che si tratti di lavorare in un laboratorio QC ad alto rendimento o di sviluppare un nuovo metodo bioanalitico, investire tempo nella comprensione e nel controllo della composizione delle fasi mobili paga dividendi in qualità di dati, robustezza dei metodi e produttività a lungo termine.