Idrogeli come mimica a matrice extracellulare nella cultura cellulare tridimensionale

La cultura cellulare tridimensionale è diventata uno strumento essenziale nella ricerca biomedica moderna perché riepiloga gli aspetti chiave del microambiente in vivo[]. Al centro di questa rivoluzione sono gli idrogeli — le reti polimeriche gonfie che possono essere progettate per imitare da vicino la matrice extracellulare nativa (ECM).

La Matrice Extracellulare: un Affaffold dinamico

Nei tessuti viventi, le cellule sono incorporate all'interno dell'ECM — una rete complessa e tridimensionale di proteine, glicoproteine e polisaccaridi. L'ECM fornisce non solo supporto strutturale, ma anche biochimico e meccanico che regolano l'adesione cellulare, la migrazione, la proliferazione, la differenziazione e la sopravvivenza.

Le cellule tradizionali a due dimensioni (2D) monostrato forzano le cellule su un substrato rigido e piatto che porta poco somiglianza a questo ambiente naturale 3D. Le cellule su plastica o vetro presentano morfologia anormale, espressione genica alterata e perdita di funzioni specifiche del tessuto.

Cosa sono gli idrogeli?

Gli idrogeli sono reti interconnesse di polimeri idrofilici che possono assorbire e conservare grandi quantità d'acqua — spesso il 90-99% del loro peso totale. Questo alto contenuto d'acqua dà loro una consistenza morbida e simile al tessuto. I collegamenti incrociati possono essere fisici (ad esempio, legami idrogeno, interazioni ioniche, entanglements a catena) o chimici (covalenti legami), e la rete risultante può essere progettata per degradare nel tempo o rimanere stabile.

Poiché gli idrogeli sono altamente permeabili all'ossigeno, ai nutrienti e ai rifiuti metabolici, possono sostenere la vitalità cellulare durante il costrutto 3D. Possono anche essere funzionalizzati con leganti ad adesione (ad esempio, peptidi RGD), fattori di crescita, o altre molecole bioattive per il comportamento cellulare diretto.

Tipi di idrogeli utilizzati per il Mimic Native ECM

Idrogeli naturali

Gli idrogeli naturali sono derivati da fonti biologiche e spesso contengono motivi bioattivi intrinseci che le cellule riconoscono.

  • Collagen type I[[] – la proteina più abbondante nei mammiferi, utilizzata ampiamente per la cultura 3D dei fibroblasti, delle cellule tumorali e delle cellule staminali.
  • Gelatin[] – collagene denaturato, spesso metacrilato (GelMA) per il foto-crosslinking. Gelatin conserva motivi violoncello-leganti e siti sensibili MMP.
  • Matrigel[ – un estratto di membrana scantinata dal sarcoma del mouse Engelbreth-Holm-Swarm. Contiene laminin, collagene IV, entactin e fattori di crescita. Matrigel è ampiamente usato per la cultura organoide e le analisi dell'angiogenesi, ma la sua origine animale-deriva introduce la variabilità batch-to-batchability.
  • Acido alaluronico (HA) – un glicosaminoglico non isolato trovato in molti tessuti. HA può essere modificato chimicamente (ad esempio, HA metacrilato) per formare idrogeli stabili.
  • Alginate[] – un polisaccaride dalle alghe che forma gel ionicamente incrociati con calcio. L'alginato è biocompatibile ma non contiene siti di legame cellulare mammifero; è spesso miscelato con altri biopolimeri.
  • Fibrin[] – formato dall'azione della tromba sul fibrinogeno. I gel di Fibrina sono utilizzati nella guarigione delle ferite e nell'ingegneria dei tessuti, e sono naturalmente degradati dal plasmin.

Gli idrogeli naturali riepitolano strettamente la complessità biochimica dell'ECM nativo, ma soffrono di limitata capacità di resistenza meccanica e potenziale immunogenicità o contaminazione.

Idrogeli sintetici

Gli idrogeli sintetici sono prodotti da polimeri artificiali con una chimica ben definita, le cui proprietà possono essere controllate con precisione e offrono una riproducibilità superiore.

  • Poly(il glicole etilene) (PEG) – la piattaforma idrogel sintetico più comune. Il PEG è biologicamente inerte, quindi deve essere funzionalizzato con peptidi di adesione e crosslinked tramite la chimica del clic, reazioni del tiol-ene, o fotopolimerizzazione acrilata.
  • Poly(alcole di vinile) (PVA)[] – può essere collegato con glutaraldeide o attraverso cicli di gelo-thaw. Gli idrogeli di PVA sono meccanicamente robusti e utilizzati per la cartilagine e la riparazione di tessuti molli.
  • Poly(2-idrossitile metacrilato) (PHEMA)] – storicamente usato per le lenti a contatto; gli idrogeli PHEMA sono stabili e possono essere modificati per la cultura 3D.
  • Poly(N‐isopropylacrylamide) (PNIPAAm) – un polimero termoresponsivo che gela oltre 32°C, permettendo la raccolta delle lamiere delle cellule.
  • Peptidi di assemblaggio di self[[] – peptidi sintetici corti che formano nanofibre di β-sheet in condizioni fisiologiche, creando un idrogelo che imita la struttura fibrosa ECM.

Gli idrogeli sintetici eliminano molte incertezze di materiali naturali, ma mancano della bioattività intrinseca richiesta per molti tipi di cellule. Pertanto, i sistemi ibridi che combinano gli spinaci sintetici con la funzionalizzazione bioattiva sono sempre più popolari.

Proprietà chiave di Hydrogels per la mimetica ECM

Proprietà meccaniche

Le cellule sentono e rispondono alla rigidità della loro matrice circostante attraverso i percorsi di mechanotransduzione. I idrogeli possono essere formulati per coprire una vasta gamma di moduli elastici — dal tessuto cerebrale morbido (~0.1–1 kPa) all'osso rigido o cartilagine (~10–40 kPa, o anche più alto). Ad esempio, gli idrogeli PEG possono essere accordati con la concentrazione dei polimeri o la densità di crosslink.

Porosità e permeabilità

La mimica ECM ideale permette una diffusione efficiente di ossigeno, nutrienti e prodotti di scarto. Le dimensioni del poro, l'interconnessione e la dimensione della maglia determinano i tassi di trasporto. Gli idrogeli sintetici possono essere progettati con porosità controllata utilizzando tecniche come la la levigatura del gelo, la leaching del sale o l'elettrospinning.

Bioattività e degradabilità

Per supportare le funzioni cellulari, gli idrogeli devono presentare i leganti di adesione (ad esempio RGD, YIGSR, IKVAV) e i siti di legame con i fattori di crescita. Dovrebbero anche essere degradabili - sia attraverso gli enzimi secreti dalle cellule (MMP-sensibili crosslinks) che con l'idrolisi - in modo che le cellule possano rimodellare la matrice, migrare e depositare il proprio ECM.

Viscoelastica

I recenti studi dimostrano che gli idrogeli viscoelastici promuovono la diffusione e la proliferazione delle cellule più efficacemente di idrogeli puramente elastici della stessa rigidità. Il design degli idrogeli che imitano le proprietà di stress-relaxazione dei tessuti specifici è un'area attiva di ricerca.

Vantaggi di idrogels oltre 2D Cultura

  • morfologia psiologica:[] Le cellule in idrogelo 3D adottano forme in vivo (ad esempio, arrotondate per cellule staminali mesenchymali, allungate per fibroblasti) piuttosto che appiattite, morfologie diffuse viste sulla plastica.
  • Differenza migliorata:[] Le cellule staminali ricevono dei buoni segnali meccanici e biochimici. Ad esempio, i progenitori neurali si differenziano in neuroni più efficacemente in idrogelo morbido che in 2D.
  • Le interazioni cellulari e a matrice cellulare:[] Le culture 3D permettono il contatto naturale tra le cellule e con la matrice, portando alla formazione di giunzioni di adesione e di giunzioni di gap.
  • Previsione della risposta al farmaco:[ Le cellule tumorali negli idrogeli 3D mostrano una maggiore resistenza alle chemioterapeutiche rispetto ai monostrati 2D, più strettamente mimizzanti nella sensibilità al tossico.
  • Cultura a lungo termine:[[] Gli idrogeli possono mantenere culture valide per settimane o mesi, mentre le culture 2D spesso diventano confluenti e senescenti entro giorni.

Applicazioni delle culture 3D basate su idrogel

Ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa

I idrogeli vengono utilizzati come ponteggi per fornire cellule in tessuti danneggiati. Ad esempio, gli idrogeli iniettabili riempiti di condrociti o cellule staminali mesenchimali sono utilizzati per la riparazione della cartilagine. Gli idrogeli a base di gelatina caricati con fattori osteogeni promuovono la rigenerazione ossea.

Cultura organidica e spheroide

Le cellule staminali seminate in Matrigel o idrogeli sintetici auto-organizzano in organoidi — organi miniaturizzati che riepitolano l'architettura e la funzione dei tessuti come l'intestino, il cervello, il fegato e il rene.

Modellazione e screening delle droghe

Le cellule tumorali coltivate in idrogeli formano gli speroidi tumorali o i organoidi disidratati da pazienti che mantengono l'eterogeneità del cancro originale. Questi modelli sono utilizzati per lo screening di farmaci ad alto rendimento e la medicina personalizzata. I idrogeli possono anche essere utilizzati per imitare l'ECM fibrotico di malattie come la sirrosi epatica o la fibrosi polmonare, fornendo piattaforme per testare composti anti-fibrotici.

Studi di angiogenesi e vascolarizzazione

Le cellule endoteliali coltivate in collagene o idrogeli di fibrina formano reti capillari-come quando stimolate con fattori angiogeni. Questi modelli sono utilizzati per studiare angiogenesi tumorale, guarigione delle ferite e efficacia anti-angiogenica della droga. L'integrazione di periciti o cellule muscolari lisce permette la costruzione di vascolatura più matura e funzionale.

Bioprinting

I idrogeli che possono essere collegati in modo controllato spazialmente (ad esempio, GelMA foto-crosslinkable o PEG-diacrylate) sono gli inchiostri primari per la biostampa 3D a base di estrusione. I costrutti stampati possono contenere più tipi di cellule organizzati in schemi anatomicamente rilevanti. La sfida rimane quella di stampare grandi costrutti con sufficiente stabilità meccanica e vascolarizzazione per mantenere la vitabilità.

Per una revisione completa delle applicazioni idrogel, vedere Nature Recensioni Materiali (2020).

Limitazioni e sfide

Nonostante i loro successi, gli idrogeli affrontano diversi ostacoli prima di una traduzione clinica diffusa:

  • La maggior parte dei idrogeli sono meccanicamente deboli e possono essere lacerati o compressi durante la manipolazione.
  • Controllo di degradazione:[] Gli idrogeli naturali si degradano spesso troppo rapidamente o imprevedibilmente. Gli idrogeli sintetici possono essere progettati con i tassi di degradazione controllati, ma i sottoprodotti devono essere atossi.
  • Variabilità della bacca:[ Matrigel e altri idrogeli derivati dagli animali soffrono di differenze di lotto-to-lot, che compromettono la riproducibilità. Il campo si sta muovendo verso idrogeli non xeno-definiti chimicamente.
  • Risposta immunitaria:[] Gli idrogeli impollati possono provocare reazioni corporee straniere, tra cui l'infiammazione, la fibrosi e l'incapsulamento.
  • Vascolarizzazione:[ I costrutti spesso ( >200 μm) richiedono un'alimentazione di sangue funzionale per prevenire la necrosi.
  • Scegli e riproducibilità:[[] Traslando un idrogel su scala di laboratorio ad un prodotto conforme a GMP richiede un controllo rigoroso della qualità delle materie prime, del crosslinking e della semina delle cellule.

Direzioni e strategie emergenti

Idrogeli intelligenti e responsabili

I idrogeli che rispondono a pH, temperatura, luce, enzimi o campi magnetici permettono il controllo dinamico del microambiente cellulare. Ad esempio, gli idrogeli che si irrigidiscono all'esposizione alla luce blu consentono ai ricercatori di studiare come le cellule rispondono a cambiamenti meccanici graduali.

Idrogeli ECM decellularizzati

Gli organi o i tessuti integrali (ad esempio, cuore, polmone, fegato) possono essere decellularizzati per rimuovere i componenti cellulari preservando l'ECM nativo. L'ECM risultante è solubilizzato e può essere ricostituito in un idrogel. Questi cosiddetti idrogeli dECM contengono il repertorio completo delle proteine ECM specifiche del tessuto, glicosaminoglicani e fattori di crescita attuali, fornendo i più autentici metodi di produzione.

Integrazione con Microfluidici e Organ‐on‐Chip

Gli idrogeli sono incorporati in dispositivi microfluidici per creare sistemi organ‐on-chip che permettano la cultura 3D con nutrienti e tossicità e rimuovere i rifiuti. Questa combinazione permette una cultura a lungo termine delle cellule umane primarie e consente studi di metabolismo, trasporto e tossicità in condizioni di flusso.

Progettazione avanzata di Hydrogel con l'apprendimento automatico

La proiezione ad alta velocità delle librerie di idrogel, la composizione dei polimeri, il tipo di crosslinker, la rigidità e la degradabilità, generano grandi set di dati. Gli algoritmi di apprendimento automatico possono prevedere la formulazione che meglio supporta un particolare tipo di cella o funzione, riducendo drasticamente il numero di esperimenti di prova-e-error.

Traduzione clinica delle terapie idrogelo-basate

Diversi prodotti idrogel hanno ricevuto l'approvazione normativa, tra cui Hyalgan (acido ialuronico per osteoartrite), Tissel (con sigillante di fibre), e DuraSeal (con sede in PEG), che probabilmente combinano idrogeli con cellule o biologici per la riparazione di cartilagine, cerotti cardiaci e guarigione delle ferite.

Per ulteriori informazioni sulle applicazioni cliniche, vedere Materiale bioattivo (2020).

Conclusioni

I idrogeli sono passati oltre le semplici matrici per l'emissione di cellule per diventare piattaforme altamente ingegnerizzate che ricapitolano la complessità molecolare, meccanica e strutturale dell'ECM nativo. Gli idrogeli naturali offrono bioattività, gli idrogeli sintetici offrono la tunabilità, e gli approcci ibridi combinano il meglio di entrambi i mondi.