Introduzione: Perché la raccolta di bioreattore definisce il successo a valle

La biofarmatura, che si basa sulla biofarmatura, determina le strategie di raccolta e di raccolta dei prodotti, che si basano su una riduzione dei costi, e che migliorano notevolmente la produzione di proteine.

Fondamenti di Bioreactor Harvesting

Il ruolo critico dell'Arvesting nel Bioprocessing

In processi di coltura cellulare dei mammiferi per gli anticorpi monoclonali, le densità cellulari tipiche variano da 10 a 20 milioni di cellule/mL, con tiri che superano i 5 g/L. Il passaggio del raccolto deve rimuovere miliardi di cellule e i loro detriti, massimizzando il recupero del prodotto (spesso >95%) e minimizzando il trasporto di impurasi

Metrics chiave di prestazione

Quando si valutano le tecniche di raccolta, gli ingegneri di processo considerano diverse metriche interconnesse:

  • Imposta:[] La percentuale del prodotto di destinazione recuperato nel flusso chiarito. Le perdite possono verificarsi a causa della separazione incompleta, del vincolo del prodotto nel pellet o nella torta filtrante, o della degradazione.
  • Clarity:[] Misurato come torbidità o conteggio delle particelle. L'elevata chiarezza riduce il peso sulla profondità successiva e sui filtri di livello sterilizzante, estendendo le loro vite e riducendo i costi di sostituzione.
  • Purità:[] Il livello di HCP, DNA e altre impurità nel flusso raccolto. Alcune tecniche (ad esempio, flocculation) possono ridurre selettivamente le impurità, facilitando la lucidatura a valle.
  • Troughput:[ La velocità di elaborazione (litri all'ora) determina il dimensionamento delle apparecchiature e il tempo complessivo del lotto.
  • Prodotto Integrity:[[] Forze di taglio, escursioni a temperatura, e tempi di residenza prolungati possono denaturare proteine, causare aggregazione, o attivare proteasi. La manipolazione del materiale è particolarmente critica per i prodotti labili.
  • Scalabilità:[] Una tecnica che funziona a scala di panca non può tradurre economicamente o tecnicamente a scala di produzione.

Tecniche di acquisizione principali e loro impatto sulla resa a valle

Centrifugazione

La centrifugazione utilizza la forza centrifuga per accelerare l'installazione di particelle basate sulle differenze di densità. Resta un cavalletto di lavoro in bioprocessing su larga scala, in particolare per le culture microbiche e i processi mammali ad alta densità cellulare.

Tipi di centrifughe

Le centrifughe a disco sono le più comuni nella produzione biofarmaceutica. Sono costituiti da una pila di dischi conici che aumentano l'area di settling, consentendo un elevato rendimento (fino a decine di migliaia di litri all'ora) .

Stress di taglio e qualità del prodotto

Le elevate velocità di rotazione e le forze di accelerazione possono danneggiare le cellule mammiferi fragili, rilasciando proteasi intracellulari e DNA che aumentano il carico di impurità a valle. Per i prodotti secreti, la guaina stessa non può danneggiare la proteina, ma il rilascio di HCP e complica la purificazione del DNA.

Tecniche di filtrazione

La filtrazione offre un'alternativa più delicata alla centrifugazione, con opzioni scalabili dal laboratorio alla produzione. Le principali modalità di filtrazione nella raccolta sono la filtrazione della profondità e la filtrazione del flusso tangenziale (TFF), ognuna con meccanismi e applicazioni distinte.

Profondità della filtrazione contro la filtrazione Membrana

I filtri di profondità] sono costituiti da una matrice porosa (cellulosa, terra diatomacea, o fibre sintetiche) che intrappola le particelle durante la profondità del filtro, non solo sulla superficie. Sono ideali per i mangimi ad alta intensità e come primo passo dopo la centrifugazione o per la raccolta diretta di processi a bassa temperatura.

Filtrazione di flusso tangenziale (TFF) per la raccolta

Il TFF, o la filtrazione a flusso incrociato, ricircola il flusso di alimentazione attraverso la superficie della membrana, riducendo l'accumulo di torte e consentendo il funzionamento continuo. Per la raccolta, le membrane TFF con dimensioni di pori di 0,1–0.5 μm conservano le cellule e detriti, consentendo al prodotto (e piccole impurità) di passare attraverso il permeato.

Strategie di fouling e di mitigazione

La rimozione — l'accumulo di cellule, detriti o materiale precipitato sulla superficie della membrana o all'interno dei pori — è la limitazione primaria della raccolta a base di filtrazione.

  • Pretrattare il feed con flocculant o adsorbents per aggregare le ammende.
  • Utilizzando canali di schermo o moduli a canale aperto per ridurre la polarizzazione di concentrazione.
  • Funzionamento in condizioni di flusso subcriticale.
  • Implementazione di retrolavaggio periodico o di dispersione dell'aria per la torta allentata.
  • Membrane di selezione con proprietà di legame proteico basso (ad esempio, PES, PVDF o ceramica).

Flocculation and Precipitation

La fluttuazione comporta l'aggiunta di agenti chimici (ad esempio, polimeri cationici, chitosani, poliacrilati) per aggregare le cellule, detriti, o anche le impurità del prodotto in gradi più grandi che si stabiliscono o filtrano più facilmente.

Tecniche di invecchiamento: Separazione acustica e sistemi a due fasi acquosi

La separazione dell'onda acustica utilizza onde stazionarie ultrasoniche per concentrare le cellule o le particelle in nodi di pressione, permettendo una continua e delicata chiarificazione senza muovere parti o cesoie. I sistemi commerciali (ad esempio, da GEA o Sonosep) possono ottenere una elevata ritenzione cellulare con un basso input energetico.

Ottimizzazione del processo per la resa massima a valle

Ottimizzazione del parametro

Per la filtrazione della profondità, i parametri chiave includono la portata del flusso (flusso), il differenziale della pressione, l'altezza del letto (per i moduli impilati), e la selezione delle dimensioni del poro del filtro. Un alto flusso iniziale può causare una rapida compressione del dolce e una maggiore efficienza, riducendo il throughput effettivo.

Monitoraggio e automazione in tempo reale

I sensori online per la torbidità, la densità cellulare (ad esempio, quasi infrarosso), e la concentrazione del prodotto (ad esempio, spettroscopia Raman) consentono agli operatori di regolare dinamicamente i record di rendimento, ad esempio, se la turbidità aumenta nel centro, il tasso di alimentazione può essere ridotto o la frequenza di scarico del contenitore aumenta.

Integrazione di Harvesting con Upstream e Downstream

I maggiori guadagni del rendimento complessivo del processo spesso derivano dalla rottura dei silos tra a monte, la raccolta e la purificazione. Ad esempio, la scelta dei media di cultura e della linea cellulare può influenzare la dimensione delle cellule, le caratteristiche dei detriti e la viscosità, influenzando direttamente la raccolta della cultura.

Studi sui casi e applicazioni industriali

Produzione di anticorpi monoclonali

La piattaforma di raccolta dominante per mAbs a scala commerciale rimane l'impronta centrifuga di disc-stack seguita da filtrazione di profondità. Per una tipica cultura di 10.000–15.000 L alimentata, la centrifuga rimuove ~95–99% delle cellule, e il successivo treno di filtro di profondità rimuove solidi residui e detriti indotti dalla cesoia.

Produzione di vaccini

La produzione di vaccini, specialmente per i vettori virali e i vaccini attenuati dal vivo, presenta sfide di raccolta uniche. Molti vaccini sono prodotti in cellule aderenti o sospensioni, con il prodotto che è il virus stesso (intracellulare o secreto).

Produzione di proteine ricombinanti in sistemi microbiali

La fermentazione microbiale (] E. coli], Pichia pastoris) spesso raggiunge densità cellulari molto elevate (>100 g/L DCW). Per la riduzione delle proteine secrete, il passaggio del raccolto deve separare le cellule dense da un brodo viscoso.

Tendenze e innovazioni future

Sistemi di monouso

Le tecnologie di uso singolo hanno proliferato a monte (bioreattori monouso) e sono ora comuni nelle operazioni di raccolta. Capsule di filtro a profondità monouso, sacchetti centrifughe monouso (ad esempio, il Thermo ScientificTM HyPerformaTM Single-Use Centrifuge]), e moduli TFF pre-sterilizzati riducono la validazione del prodotto di pulizia, il tempo di conversione

Rivestimento continuo di bioprocessing e perfusione

La produzione continua è una tendenza importante nel biofarmaco, e la raccolta è naturalmente integrata nei processi di perfusione. In perfusione la cultura, un dispositivo di ritenzione cellulare (filtro TFF, separatore acustico, o colonizzazione di gravità) rimuove continuamente il mezzo speso mentre conserva le cellule. Il permeato raccolto viene poi pompato direttamente in un passo di cattura in un continuo sistema di cromatografia multicolonna.

Materiali Membrana avanzati e Nanofiltrazione

Le membrane in ceramica offrono una durata maggiore e possono essere pulite aggressivamente, riducendo i costi di sostituzione. Le membrane di nanofiltrazione (dimensione del pH 1-10 nm) possono anche rimuovere virus e piccole impurità durante la fase di raccolta, potenzialmente collassando le operazioni di più unità.

Conclusioni

La raccolta di bioreattori non è più una semplice separazione di liquido solido; è un'operazione strategica che influenza direttamente la resa, la purezza e il costo della produzione biofarmaceutica.