La conservazione della sterilità nei laboratori di cultura cellulare è fondamentale per la riproducibilità e la validità dei risultati sperimentali. Gli eventi di contaminazione, sia batteriche, fungine, micoplasmatiche o cross-cellulari, possono invalidare settimane o mesi di lavoro, rifiuti costosi reagenti e compromette l'integrità dei dati.

Fonti di contaminazione nella cultura cellulare

Capire dove provengono i contaminanti è il primo passo verso la prevenzione. Le fonti primarie cadono in diverse categorie:

Personale

I flakes della pelle, le gocce respiratorie e i capelli capannoni possono portare batteri e funghi nell'area di lavoro. Anche un singolo tocco della mano non lucida su un tappo di vasi di cultura può introdurre Staphylococcus o Aspergillus spore [Fughwalk]

Ambiente e qualità dell'aria

L’aria di laboratorio contiene particelle sospese, comprese le spore microbiche. Il lavoro di cultura cellulare deve essere eseguito all’interno di un certificato Class II Biosafety Cabinet (BSC)[]] che fornisce aria filtrata HEPA. Tuttavia, anche un BSC può essere compromesso se la gestione dell’aria della stanza è insufficiente o se il gabinetto è posizionato vicino a porte, sfi o aree ad alta condensazione.

Forniture e Reagenti

I mezzi di comunicazione culturale, sera, la trippa e gli antibiotici possono essere contaminati durante la produzione, lo stoccaggio o la manipolazione. Sebbene i media commerciali siano stati filtrati in modo sterile, lo stoccaggio improprio, come lasciare le bottiglie non coperte o usarle per la loro scadenza passata, possono consentire la crescita microbica.

Linee cellulari

Il micoplasma è il contaminante più insidioso perché non produce torbidità visibile o cambiamento di pH. Gli studi stimano che 15-35% delle culture cellulari in uso comune sono micoplasma-positivo, spesso senza la conoscenza del ricercatore.

“La contaminazione di Mycoplasma può alterare praticamente ogni parametro cellulare studiato, tra cui l’espressione genica, il metabolismo e la risposta ai farmaci.

Pratiche fondamentali per mantenere la sterilità

Lavoro in un Governo di Biosicurezza Certificata (BSC)

Il BSC è il pezzo più importante per la cultura cellulare sterile, che fornisce un flusso d'aria filtrato HEPA che protegge sia l'operatore che le culture. Per il lavoro di cultura cellulare, un Class II, Tipo A2] è standard.

  • Certificazione e manutenzione:[ Il BSC ha certificato annualmente (o più spesso) da un tecnico qualificato.
  • Uso corretto:[] Tenere il sash all'altezza corretta. Evitare di bloccare le griglie anteriori o posteriori. Posizionare tutti gli elementi all'interno del cabinet prima di iniziare il lavoro: una volta che il flusso d'aria è stabilito, evitare movimenti rapidi del braccio che possono interrompere il campo sterile.
  • Caricamento e scarico:[] Disinfettare tutti gli elementi (bottiglie multimediali, punte pipette, flauti) con il 70% di etanolo prima di metterli nel BSC. Arrangiate i materiali in modo che le aree pulite (bottiglie multimediali) siano separate dai rifiuti ( pipette usate).
  • Luce ultravioletta:[ Molti armadi hanno una luce UV per la decontaminazione tra gli usi. Utilizzare per almeno 15 minuti dopo il lavoro, ma si noti che UV non è un sostituto per la disinfezione superficiale con etanolo.

Igiene a mano e attrezzature di protezione individuale

Anche con un BSC, le mani dell'operatore sono una fonte di contaminazione primaria. Mani in alto[] con un sapone antimicrobico prima di entrare nell'area della cultura cellulare. Indossare guanti nitrili senza polvere o lattice che si adattano bene. Dopo aver donato guanti, spruzzarli con il 70% di etanolo e permettere loro di asciugare aria; ripetere periodicamente.

  • Cambiamenti di amore:[] Cambiare i guanti immediatamente se toccano qualcosa di non-sterile—l'esterno di una bottiglia di media, bracciolo di una sedia, un fermaporta, o il tuo volto.
  • Custoncini:[] Indossare un cappotto di laboratorio dedicato che viene utilizzato solo nella suite di cultura cellulare.
  • Maschera di pace e coperture di capelli:[ Una maschera chirurgica riduce la spargimento di goccia, e un capello di pettinatura o bouffant impedisce ai capelli sciolti di cadere nelle culture.Per il lavoro di alta consequenza (ad esempio, le cellule primarie o le celle per uso clinico), uno scudo di faccia piena può essere appropriato.

Attrezzature e forniture sterili

Ogni elemento che entra in contatto con culture o media deve essere sterile. Questo include pipette, punte pipette (con filtri), flaschi, tubi centrifughi e criovials. Utilizzare solo certified sterile[]] plastiche monouso; evitare di riutilizzare oggetti monouso.

  • Media e integratori:[] Sterilizzare componenti sensibili al calore (ad esempio antibiotici, vitamine, fattori di crescita) filtrando attraverso un filtro da 0,22 μm. I supporti pre-riscaldati devono essere utilizzati immediatamente e non lasciati a 37°C per periodi prolungati.
  • Acqua:[] Per la cultura cellulare, usare solo acqua o acqua di qualità USP che è stata dionizzata e poi filtrata sterile. Evitare l'acqua distillata da residui metallici, che possono introdurre endotossine.
  • Gestione dell'incubatore:[] Incubatori puliti regolarmente—rimodellare scaffali e pentole d'acqua con un disinfettante (ad esempio, 70% etanolo o un composto di ammonio quaternario).

Minimizzare i vasi di cultura aperti

Ogni momento è aperto un vaso di cultura, è vulnerabile. Sfrutta il tuo flusso di lavoro[] in modo da poter eseguire tutte le manipolazioni in modo rapido ed efficiente.

  • Lavorare in lotti:[] Quando si elaborano culture multiple, pugnalare il vostro lavoro in modo che non si stiano mai contemporaneamente aggrappati a diversi flauti aperti.
  • Pipetting:[] Usare una pipetta sterile separata per ogni trasferimento liquido. Mai immergere la stessa pipetta in una cultura e poi tornare in uno stock multimediale.
  • L'uso di antibiotici: Mentre la penicillina-streptomicina o la gentamicina possono sopprimere alcuni contaminanti batterici, non uccidono il micoplasma o i funghi. L'over-reliance sugli antibiotici può anche mascherare la contaminazione a basso livello. La migliore pratica è di lavorare senza antibiotici per la cultura di routine e si basano esclusivamente sulla tecnica sterile.

Disinfettare superfici di lavoro e attrezzature

Prima e dopo ogni sessione di lavoro, pulire tutte le superfici all'interno del BSC con un disinfettante. 70% etanolo[] è la scelta più comune perché evapora rapidamente ed è efficace contro molti batteri e virus. Tuttavia, non uccide tutti i residui di spore-formanti; per la decontaminazione più profonda, ruotare con un disinfettante sporicidale (es.

  • Pulitura calda:[ Almeno una volta alla settimana, rimuovere tutti gli elementi dal BSC e pulire accuratamente l'interno con un detergente sporicidale, poi con il 70% di etanolo. Lascia che il gabinetto funzioni per almeno 10 minuti dopo per eliminare eventuali vapori.
  • Al di fuori del BSC:[]] Disinfettare i piani di panca, le maniglie di incubatore, gli oculari del microscopio e le tastiere del computer regolarmente.

Migliori pratiche ampliate per la stabilità a lungo termine

Progettazione e flusso di lavoro del laboratorio

Il layout fisico del laboratorio di cultura cellulare può aiutare o ostacolare la sterilità. Idealmente, il laboratorio dovrebbe avere un'area dedicata “pulita” separata da microbiologia generale o spazi di biologia molecolare. Pressione dell'aria positiva[[] nella sala di cultura cellulare (relativa al corridoio) costringe l'aria fuori, impedendo l'ingresso di aria non filtrata.

  • Trasferimento della camera:[] Limitare l'accesso al personale addestrato. Non usare la sala cultura della cella come area di camminata o di stoccaggio.
  • Panificare flussi puliti e sporchi:[ Idealmente, ci dovrebbe essere un “corridoio pulito” per l’ingresso (modifica, stoccaggio di scorte sterili) e un percorso separato per la rimozione dei rifiuti. Anche se questo è un lusso in molte strutture, semplicemente progettando una panca pulita e una panca di protezione rifiuti all’interno del laboratorio può aiutare.

Monitoraggio e test per contaminazione

Il monitoraggio delle routine è essenziale, anche quando non è evidente la contaminazione visibile. I laboratori di cultura cellulare dovrebbero avere un piano di monitoraggio della contaminazione che include:

  • I test Mycoplasma:[] Usa metodi basati su PCR o basati sulla cultura per il rilevamento di mycoplasma.
  • Proiezione seriale e fungina:[ Inoculare un piccolo aliquota di cultura supernata (o speso medio) in brodo di soia provetta e mezzo tioglicollato. Incubare a 30-37°C per 14 giorni; ispezionare visivamente ogni giorno per la torbidità.
  • Campionamento superficie:[ Swab BSC superfici, interni incubatori e piani in panca con una palude in cotone sterile, poi strizzare su piastre di agar sanguigni.
  • Ricerca di qualità dell'aria:[] Usare piatti di colonia (aperti con agar) lasciati all'interno del BSC e nella stanza per 1-4 ore.

Gestione della contaminazione sospetta

Nonostante i migliori sforzi, la contaminazione può ancora verificarsi.

  1. Isolare il vaso:[] Spostare la cultura contaminata in una zona di quarantena lontano da altre culture.
  2. Identificare il contaminante:[] Esaminare la morfologia tramite microscopia (i batteri possono essere barre o cocci; i funghi mostrano ifae).
  3. Il recupero di tenta (se critico): Per il miocoplasma, utilizzare un regime di eliminazione convalidato (ad esempio, il trattamento con BM‐Cyclin o Plasmocin). Per batteri o funghi, la decontaminazione è raramente riuscita; è generalmente più sicuro scartare la cultura e ottenere un vial fresco dallo stock originale.
  4. Decontaminare il BSC e le attrezzature:[] Usare uno sporicido o una candeggina per pulire a fondo il gabinetto, l'incubatore e qualsiasi elemento che possa essere stato esposto.
  5. Document the event:[ Registrare ciò che è successo, la fonte probabile e le azioni correttive intraprese.

Formazione e cultura dell'Asepsi

L’attrezzatura più costosa nel laboratorio di cultura cellulare è inutile se la tecnica dell’operatore è povera. La formazione iniziale e continua è fondamentale. Il personale nuovo dovrebbe essere osservato eseguendo il lavoro di cultura del mock (utilizzando acqua sterile o colorante alimentare invece di culture vive) prima di essere permesso di lavorare con le cellule.

  • Drills and audits: Condurre controlli periodici di tecnica asetica, ad esempio, avere un esperto tecnico guardare un tirocinante e segnare ogni passo (lavaggio manuale, carico BSC, pipettaggio, navi di chiusura).
  • Controllisti:[]] Creare una lista di controllo giornaliera che include: “Ho pulito il BSC prima di iniziare? Sono guanti disinfettati? Tutti gli elementi posti nel BSC prima di portare le culture?” Usalo come un rinfrescatore mentale.
  • Guida di book aperto:[] Inviare una scheda di riferimento rapida laminata all'interno dell'area BSC sintetizzando i passaggi chiave: lavare le mani, spruzzare di etanolo, caricare materiali, vaso aperto, trasferire, chiudere il vaso, rimuovere, pulire.

Considerazioni speciali per celle primarie e celle staminali

Le cellule primarie (ad esempio, fibroblasti umani, epatociti) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono generalmente più sensibili e richiedono una sterilità ancora più rigorosa.

Incubatore Igiene e Gas Supply

La manutenzione di resina[] include il lavaggio di mensole e porte settimanali, la pulizia della pentola dell'acqua con un mensile disinfettante e la sostituzione dei filtri HEPA (se equipaggiati) per raccomandazioni del produttore.

Conclusioni

La sterilità nella cultura cellulare è una disciplina continua che richiede attenzione ai dettagli in ogni fase, dal design architettonico del laboratorio e dalla qualità dell’aria al lavaggio quotidiano della mano dell’operatore e alla rimozione finale del gabinetto di biosicurezza.