La capacità di leggere il modello genetico degli organismi viventi ha trasformato la ricerca biologica, ma per decenni quella potenza è stata bloccata all'interno di edifici di laboratorio con macchine costose e spaziose. I ricercatori che hanno bisogno di dati genomici da foreste pluviali remote, pavimenti oceanici, o zone di scoppio hanno affrontato un collo di bottiglia frustrante: raccogliere il campione, conservarlo, spedirlo a un laboratorio e aspettare settimane per i risultati.

Introduzione alla Sequenziamento genomico portatile

Il sequenziamento genomico portatile si riferisce alla capacità di eseguire il DNA o il RNA sequenziando al di fuori di un ambiente di laboratorio tradizionale, spesso utilizzando strumenti a batteria, compatti. Il concetto non è completamente nuovo - le macchine PCR primi-deployable-esistrò - ma la capacità di sequenza interi genomes o transcriptomes in situ rappresenta un salto quantistico.

I sequencer portatili consentono ai ricercatori di ottenere informazioni genomiche in tempo reale, accelerando tutto dall'identificazione delle specie durante le indagini sulla biodiversità per monitorare l'evoluzione di un virus durante un'epidemia. Il dispositivo più noto, la MinION da Oxford Nanopore Technologies, pesa meno di 100 grammi e collega in un computer portatile tramite USB.

Principali sottopinning tecnologici

Sequenziamento di nanopore

Il nanopore proteico è incorporato in una membrana sintetica, e una corrente ionica viene applicata. Come una molecola del DNA a singolo filamento passa attraverso il poro, ogni nucleotide (o gruppo di nucleotidi) interrompe la corrente in modo caratteristico. Misurando queste interruzioni in tempo reale, il sequencer determina la sequenza di basi.

Preparazione della Biblioteca nel campo

Una delle più grandi ostacoli per la sequenziamento del campo è preparazione del campione. La preparazione della biblioteca tradizionale comprende più passaggi: l'estrazione del DNA, la frammentazione, la riparazione finale, la ligation dell'adattatore e la purificazione—molti che richiedono centrifughe, termocicli e stoccaggio freddo.

Analisi Basecalling e Real Time

I segnali elettrici prodotti dai sequencer nanopori devono essere convertiti in chiamate base, un processo chiamato basecalling. I dispositivi precedenti si basano su software cloud-based o desktop, ma i flussi di lavoro portatili moderni includono basicalling locale utilizzando GPUs incorporati in un computer portatile o anche sul dispositivo di sequenziamento stesso (ad esempio, la MinION Mk1C ha un computer integrato).

Milestones in Sviluppo di Sequenziamento Genomico Portatile

Il viaggio dal laboratorio di sequenziamento solo ai dispositivi mobili è stato segnato da diverse pietre miliari chiave che illustrano sia il progresso tecnologico che la risoluzione dei problemi creativi da parte dei ricercatori.

Programma di accesso anticipato della MinION (2014)

Nel 2014, Oxford Nanopore ha lanciato il MinION Access Programme (MAP), fornendo unità iniziali a una comunità globale di ricercatori. I risultati iniziali sono stati misti - l'accuratezza era bassa, il throughput era variabile e il dispositivo ha richiesto una configurazione meticolosa. Tuttavia, il MAP ha generato un'esplosione di sviluppo dei metodi come gli utenti hanno condiviso protocolli e soluzioni di lavoro.

Ebola in tempo reale e la sorveglianza Zika

Durante il 2014-2016 Ebola scoppio in Africa occidentale, una collaborazione tra Oxford Nanopore, il Laboratorio Europeo Mobile, e il Centro di Eccellenza Africana per la Gemica delle Malattie Infettive ha usato i sequencer MinION per generare genoma virali in tempo reale.

Sequenziamento antartico e profondo

Nel 2019, un team guidato dal British Antarctic Survey ha sequenziato il DNA del pesce all'interno di una stazione di ricerca in Antartide, utilizzando una Minion per studiare adattamenti alle temperature fredde. Il dispositivo ha operato a temperature sotto zero con solo piccole modifiche (tenendo il computer portatile e il sequencer caldo all'interno di una scatola di plastica temperato).

La SARS-CoV-2 Pandemic: un catalizzatore di adattamento di massa

La MinION, insieme alle più economiche cellule di flusso di Flongle, è diventata strumenti di scelta per la sorveglianza virale in tempo reale in molti paesi. La rete ARTIC ha sviluppato un protocollo per la sequenziamento di amplificatori di sequenza stagnata del genoma SARS-CoV-2 utilizzando la tecnologia nanopore, che è stata adottata da laboratori in tutto il mondo, tra cui molti in bassa risorsa

Impatto sulla ricerca sul campo ecologico e della conservazione

Valutazione della biodiversità tramite DNA ambientale (eDNA)

Una delle applicazioni più promettenti di sequenziamento portatile è l'analisi del DNA ambientale (eDNA) - materiale genetico versato da organismi in acqua, suolo o aria. Tradizionalmente, campioni di eDNA sono raccolti e inviati a un laboratorio per la metabarcoding (amplificazione e sequenziamento geni marcatori come COI o 12S).

La fauna selvatica e la depurazione del poaching

Le autorità possono sequenziare i prodotti animali confiscati (avorio, corno di rinoceronte, scale) sul sito per determinare la specie, l'origine geografica, e anche l'identità individuale dell'animale. La natura in tempo reale dell'analisi consente alle specie di imporre decisioni immediate - ad esempio, reindirizzando le pattuglie basate sulla firma genetica di un attacco.

Monitoraggio della salute della barriera corallina

I ricercatori utilizzano sequencer portatili per monitorare il microbiome dei coralli e la presenza di agenti patogeni come Vibrio[[FLT: 1:1]]] specie. In uno studio del 2021, gli scienziati hanno implementato un laboratorio mobile su una barca nella Grande barriera corallina, eseguendo il sequenziamento completo dei campioni di corallo rilevati in ore.

Impatto sulla gestione delle malattie infettive

Identificazione patogena sul posto e epidemiologia genomica

Durante gli scoppi di malattia, la velocità è critica. Sequenziatori portatili permettono ai medici e agli epidemiologici di identificare il patogeno causale da un campione di pazienti entro poche ore. Ad esempio, nel 2018 scoppio della febbre Lassa in Nigeria, un team di sequenziamento mobile ha usato una Minion per generare genoma virale e confermare la presenza di virus Lassa in casi sospetti, escludendo altre febbri emorragiche.

Sorveglianza antimicrobica della resistenza

La resistenza antimicrobica (AMR) è una crisi sanitaria globale, e la sorveglianza dei geni di resistenza è essenziale per il trattamento guida. La sequenziamento portatile consente lo screening AMR in ospedali a bassa risorsa, fattorie e anche acque reflue. I ricercatori possono sequenzare gli isolati batterici o DNA metagenomico da campioni clinici o ambientali e rilevare i geni di resistenza contro banche dati come CARD o ResFinder.

Epidemiologia basata sulle acque reflue

La sorveglianza delle acque reflue per SARS-CoV-2 è diventata uno strumento di salute pubblica chiave durante la pandemia. La sequenziamento portatile ha permesso di analizzare campioni di acque reflue nelle comunità remote dove l'invio di campioni a un laboratorio centrale è impraticabile. Nel 2021, i ricercatori in Uganda hanno implementato una Minion per la sequenza di frammenti SARS-CoV-2 da acque reflue in Kampala, generando i dati varianti che informano la risposta locale di sorveglianza COVID-19.

Sfide e limitazioni

Nonostante i notevoli progressi, il sequenziamento genomico portatile non è senza sfide significative che devono essere affrontate per un'implementazione di campo molto diffusa e affidabile.

Durata della batteria e alimentazione

La sequenza richiede un potere continuo sia per il dispositivo che per il computer connesso (a meno che non utilizzi modelli integrati come il Mk1C). Nei siti di campo remoto, l'accesso all'elettricità della rete può essere assente. Mentre i pannelli solari e le banche di energia portatili possono aiutare, le richieste energetiche di base in tempo reale su un computer portatile possono scaricare rapidamente le batterie.

Memorizzazione e connettività dei dati

Un tipico esecutore di Minion produce decine di gigabyte di file di segnale elettrico (formato FAST5 o POD5). Memorizzando, trasferendo e analizzando questi dati su un computer portatile con archiviazione limitata è impegnativo. In campo, la connettività internet è spesso scarsa o inesistente, impedendo analisi basate su cloud. I ricercatori devono trasportare hard disk esterni o utilizzare dispositivi di calcolo portatili con sufficiente RAM e GPU.

Integrità del campione e condizioni ambientali

I campioni di campo sono spesso mescolati, a bassa concentrazione, o degradati a causa di calore, umidità o esposizione chimica. Il sequencer portatile stesso deve sopportare polvere, umidità, vibrazioni e temperature estreme. Mentre la MinION e il Flongle sono ragionevolmente robusti, l'elettronica associata (laptops, alimentatori) sono più fragili.

Precisione e produttività

I parametri di misurazione del flusso di nanopore sono molto elevati, ma la precisione del consenso per le corse portatili, soprattutto in condizioni di campo con un controllo limitato sulla temperatura e sulla qualità del campione, può ancora essere in ritardo dietro il mequencing di Illumina per alcune applicazioni.

Formazione e competenza

Mentre il sequenziamento portatile è più accessibile del sequenziamento di laboratorio tradizionale, richiede ancora una notevole esperienza. I ricercatori di campo devono imparare l'estrazione del DNA, la preparazione della biblioteca, il caricamento delle celle di flusso, la basecalling e l'analisi della bioinformatica. La curva di apprendimento è ripida, e molti progetti si affidano a un piccolo numero di individui addestrati.

Le direzioni e le innovazioni future

Il campo di sequenziamento genomico portatile si sta evolvendo rapidamente, e diversi sviluppi entusiasmanti sono all'orizzonte che promettono di affrontare le limitazioni attuali e di espandere le applicazioni.

Integrazione dell'intelligenza artificiale per l'analisi in tempo reale

L’intelligenza artificiale (AI) e l’apprendimento automatico sono integrati in algoritmi di base e analisi a valle. Ad esempio, il gruppo di ricerca dietro il Basecaller Guppy (ora Bonito) ha incorporato reti neurali ricorrenti e modelli di trasformatori per migliorare l’accuratezza e la velocità. In futuro, l’AI potrebbe abilitare la chiamata variante del dispositivo, l’identificazione delle specie e anche l’annuncio funzionale di sequenze sconosciute.

Robustezza e Autonomia dei dispositivi migliorati

I produttori stanno lavorando su dispositivi di sequenziamento completamente integrati e autocontenuti che combinano la cella di flusso, fluidi, fonte di energia e computazione in un'unica unità robusta.

Applicazioni ampliate in agricoltura e sicurezza alimentare

I sequencer portatili probabilmente diventeranno strumenti standard per le prove sul campo agricolo, permettendo agli allevatori di eseguire la selezione genomica in movimento. Gli agricoltori potrebbero testare i microbiome del terreno per ottimizzare l'uso dei fertilizzanti, identificare gli agenti patogeni vegetali presto e tracciare la contaminazione nella catena di approvvigionamento alimentare. Ad esempio, un sequencer portatile a un impianto di imballaggio di produzione potrebbe fare lo schermo per

Conservazione Genomics e Biobanking

La genomica della conservazione si basa sempre più sul campionamento non invasivo e sul monitoraggio genetico in tempo reale. Il sequenziamento portatile può sostenere la creazione di "buoni genetici" per gli esemplari selezionati, consentendo l'identificazione rapida delle specie e la genetica della popolazione senza la necessità di trasportare campioni.

Verso una piattaforma veramente universale, a basso costo

L'obiettivo finale della sequenziamento genomica portatile è quello di renderlo comune come uno smartphone o una fotocamera digitale nella ricerca sul campo. Ciò richiede una riduzione continua dei costi – sia in anticipo che per campione – e il miglioramento nella facilità d'uso.

Conclusioni

Lo sviluppo di dispositivi di sequenziamento genomico portatili ha cambiato fondamentalmente ciò che è possibile nella ricerca sul campo. Dal tracciare Ebola in Africa occidentale per sequenziare il microbiome del pesce antartico, questi strumenti compatti hanno dimostrato che l'analisi genomica non richiede più un laboratorio di mattoni-e-drimita. I vantaggi sono profondi: risultati più veloci, costi più elevati, maggiore accessibilità e la capacità di prendere decisioni di data-driven in tempo reale.

Per ulteriori informazioni, visitare il sito web di Oxford Nanopore Technologies (nanoporetech.com), i protocolli di sequenziamento del campo di ARTIC Network (artic.network[]]), e il codice a barre del sistema di dati di vita (boldsystem.