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Introduzione: La necessità di precisione nella biologia cellulare
La biologia moderna richiede sempre più la capacità di studiare le cellule non come popolazioni mediate ma come singoli giocatori all'interno di sistemi complessi. Se si probano i driver genetici di un tumore, decodifica i circuiti neurali del cervello, o capire come le cellule staminali si differenziano, i ricercatori richiedono metodi per isolare i tipi di cellule specifiche con precisione chirurgica.
Questo articolo offre una panoramica tecnica completa di LCM, dai suoi principi fondamentali e dal flusso di lavoro graduale alle sue diverse applicazioni, alle sfide comuni e alle innovazioni emergenti. Scritto per ricercatori e professionisti di laboratorio, il contenuto sottolinea strategie pratiche per raggiungere l'isolamento cellulare privo di contaminazione di alta qualità.
Che cosa è la microdissezione di Cattura Laser?
Laser Capture Microdissection (LCM) è una tecnica senza contatto, microscopio-guida che utilizza un laser per tagliare e isolare celle specifiche o gruppi di cellule da un campione di tessuto solido o un monostrato cellulare colto. Il metodo è stato sviluppato per la prima volta a metà degli anni novanta presso gli istituti nazionali di salute, principalmente per affrontare la necessità di popolazioni di cellule pure in genomica del cancro.
Il principio fondamentale è notevolmente semplice: una sezione istologica colorata o un piatto di cellule coltivate è posto sulla fase di un microscopio invertito specializzato. L'operatore vede il campione, identifica le cellule di interesse basate sulla morfologia, la colorazione istochimica, o i marcatori fluorescenti, e poi utilizza un laser controllato dal computer per tagliare intorno a quelle cellule. Il materiale isolato viene poi raccolto in un tubo per l'estrazione di acidi nucleici, proteine, catture, Lmetaboliti, L.
Le caratteristiche del viso di LCM includono:
- Alta risoluzione spaziale:[]] Può isolare singole cellule o piccoli gruppi.
- Danni negativi:[ L'energia del laser è concentrata con precisione, riducendo i danni termici alle celle adiacenti.
- Guida virtuale:[] Morfologia e selezione specifica delle celle di guida di colorazione.
- Compatibilità con saggi a valle:[] Il materiale raccolto funziona con PCR, microarray, RNA-seq e spettrometria di massa.
Il flusso di lavoro LCM: una guida passo-passo
LCM di successo richiede un'attenta attenzione a ogni fase del flusso di lavoro, dalla preparazione del campione alla raccolta.
1. Preparazione e fissaggio del campione
La maggior parte dei protocolli raccomanda tessuto congelato] incorporato in un ottimale composto di temperatura di taglio (OCT), sezione a 5-10 μm spessore, e montato su speciali membrane (ad esempio, PEN o PET membrane) che si possono spostare le cellule in modo diretto sulle membrane di scorrimento.
2. Tenere per la visualizzazione
Per identificare le cellule di interesse, la sezione è macchiata. Hematoxylin e eosin (H&E) è la macchia più comune per l'identificazione basata sulla morfologia, ma immunohistochemistry (IHC) o immunofluorescenza (IF) può essere utilizzato per colpire specifici marcatori proteici.
3. Selezione microscopica e target
Lo slide viene posizionato sulla fase del microscopio del sistema LCM. L'operatore utilizza una fotocamera digitale ad alta risoluzione e un'interfaccia software per la scansione del campione. Utilizzando immagini a campo luminoso o fluorescenza, celle corrispondenti a criteri predefiniti (ad esempio, Ki-67-positivo, GFAP-positivo, o celle con nuclei atipici) vengono selezionate attraverso il disegno di regioni di interesse sullo schermo.
4. taglio laser (disezione)
Sono utilizzate due tecnologie laser principali: UV (ultraviolet) laser di taglio e IR (infrarosso) cattura laser. laser UV (355 nm) ablate un percorso stretto intorno alle celle selezionate, tagliando attraverso il tessuto e la membrana.
5. Collezione di celle isolate
I metodi per la raccolta delle cellule dissezionate variano a seconda del sistema.
- La pressione del laser catapulta (LPC):[ Un breve impulso laser ad alta energia solleva il pezzo di tessuto tagliato nell'aria, dove viene catturato da un tappo tubo rivestito di adesivo o riempito di buffer.
- Crescono di cappuccio adesivo:[ Dopo il taglio, un tappo con materiale adesivo viene premuto sul campione e sollevato, prendendo le celle di taglio con esso.
- Opzione gravitazionale:[ Il pezzo tagliato cade in un tubo posizionato sotto la fase.
Il materiale raccolto viene immediatamente inserito nel buffer di lisi o nel mezzo di estrazione per preservare l'integrità molecolare.
Tipi di sistemi LCM
Comprendere le differenze tra le piattaforme LCM aiuta i ricercatori a scegliere il miglior approccio per la loro applicazione specifica.
| Feature | UV Laser Cutting | IR Laser Capture |
|---|---|---|
| Laser type | Pulsed UV (355 nm) | Continuous IR (800 nm) |
| Mechanism | Photoablation (cuts tissue) | Thermal adhesion to film |
| Resolution | Single cell possible | Typically groups of cells |
| Speed | Fast | Fast (capture step) |
| Sample type | Thin sections, membranes | Thick sections possible |
| RNA preservation | Excellent (no heat) | Good (brief heat pulse) |
I sistemi commerciali più diffusi includono il MicroBeam Carl Zeiss PALM (lanciatura UV, UV, basato su LMD6/LMD7 (il taglio UV, la raccolta di gravità), e l'ArcturusXT (il sistema IR e UV combinato).
Applicazioni chiave nella ricerca biologica
LCM è stato determinante per il progresso di numerosi campi, qui di seguito sono esempi rappresentativi con significato del mondo reale.
Cancro genomica e eterogeneità del tumore
I tumori solidi sono un mosaico di cellule maligne, cellule stromali, cellule immunitarie e vascolatura. La sequenziamento ingombrante può mascherare le mutazioni dei driver critici presenti solo in un sottoclone spaziale. LCM consente l'isolamento delle cellule tumorali puri da regioni specifiche (ad esempio, il fronte invasivo, i nuclei necrotici, o nicchie perivascolari).
Neuroscienze: Ricodifica dei circuiti neurali
Il cervello contiene centinaia di tipi di cellule interminabili a scale microscopiche. LCM consente ai ricercatori di isolare neuroni specifici che esprimono un particolare marcatore (ad esempio, idrossilasi della tirosina nei neuroni dopaminergici) da sezioni congelate. Questo ha permesso la profilazione dell'espressione genica nei neuroni della malattia di Parkinson o l'identificazione di subtipi neuronali unici nella corteccia.
Biologia dello sviluppo e ricerca sulle cellule staminali
LCM è stato utilizzato per isolare la cresta neurale, il notochord, o il germoglio di arti dai primi embrioni per studiare programmi trascrizionali specifici dello stadio. Nelle culture delle cellule staminali, LCM può isolare colonie morfologicamente distinte (ad esempio, pluripotente vs. differenziate) per analisi comparativa senza la necessità di FACS, che possono stressare le cellule.
Analisi del DNA forense e archeologico
LCM sta emergendo come strumento nella genetica forense per raccogliere piccolissimi numeri di cellule (ad esempio, da campioni di DNA o cellule spermatozoi di macchie miste) per la profilazione a corto raggio (STR) a valle. Viene applicato anche nella paleogenomica per isolare i tipi di cellule specifiche da tessuti mummificati o conservati, minimizzando la contaminazione da microbi ambientali.
Superare le sfide comuni in LCM
Nonostante il suo potere, LCM richiede un'attenta ottimizzazione, le seguenti sfide sono spesso incontrate e possono essere mitigate con i protocolli appropriati.
Integrità e contaminazione RNase
Per mantenere l'integrità del RNA, tutti i reagenti e le diapositive devono essere RNase-free. Lavorare in un ambiente privo di RNase, utilizzare il pirocarbonato dietile (DEPC)-trattato acqua, e mantenere i campioni freddi durante il taglio (utilizzare una fase fredda).
Contaminazione da celle circostanti
Poiché LCM è visivo, il rischio di includere le cellule indesiderate è più alto lungo il bordo del taglio. Per ridurre la contaminazione, disegnare il percorso di taglio con un margine di 5-10 μm lontano dalle celle di destinazione quando possibile. Per le popolazioni molto rare, un approccio a due fasi (prima tagliare una regione più grande, poi tagliare un nucleo puro) può migliorare la purezza.
Limitazioni di importo campione
Per RNA, utilizzare i passi di pre-amplificazione (ad esempio, l'amplificazione lineare o i metodi basati su PCR) ma essere consapevoli del bias. Per le proteine, le tecniche di amplificazione del segnale (ad esempio, l'amplificazione del segnale di tiramide) o le regioni di spettrometria di massa di microscalamento sono necessarie.
Migliori Pratiche per LCM Successivo
Sulla base dell'esperienza di molti laboratori, le seguenti linee guida aumentano i tassi di successo:
- Ottimizzare lo spessore della sezione:[ 5–7 μm per RNA, 7–10 μm per DNA/proteina.
- Usa le diapositive della membrana:[ Le membrane del naftalato del polietilene (PEN) forniscono un taglio pulito con detriti minimi.
- Prova a freddo:[] Tagliare a -20°C temperatura di fase per sopprimere l'attività RNase.
- Tempo di colorazione:[[] Quick H&E o utilizzare cresyl viola (0,5% per 30 secondi) per ridurre al minimo la perdita molecolare.
- Utilizza controlli negativi:[] Includere una cattura di buffer solo e una cattura di un'area senza celle per controllare la contaminazione.
- Calibrare il laser ogni giorno:[ Potenza laser, messa a fuoco e velocità di taglio bisogno di regolazione per ogni tipo di campione.
Per un riferimento dettagliato del protocollo, vedere il LCM protocollo sullo scambio di protocolli[].
Le direzioni e le innovazioni future
Il campo della microdissezione di cattura laser si sta evolvendo rapidamente, guidato dall'integrazione delle tecnologie avanzate.
Integrazione con Omics monocellulari e spaziali
Le piattaforme di sequenziamento di prossima generazione permettono ora l'analisi transcriptomica da singole cellule LCM. L'accoppiamento LCM con trascrizione inversa microfluidica o nanolitro-scala consente di ottenere una trascrizione inversa a singola cella, che è stata risolta in modo spaziale.
Automazione e apprendimento automatico
Il nuovo software incorpora l'apprendimento automatico delle macchine per identificare automaticamente i tipi di cellule basati sulla morfologia nucleare o sull'intensità della colorazione. Questi algoritmi possono tracciare i confini delle cellule e pianificare percorsi di taglio ottimali, aumentando la produttività e la riproducibilità.
LCM Live-Cell
Tradizionalmente LCM viene eseguito su campioni fissi o congelati. Le recenti innovazioni permettono la cattura di cellule viventi da piatti di cultura utilizzando un laser IR a bassa potenza per attaccare delicatamente le cellule a un film, che vengono poi colturati o analizzati.
Multimodale LCM
Combinando LCM con altre tecniche di microscopia (ad esempio, spettroscopia Raman o microscopia multifotonica) consente la selezione basata su caratteristiche chimiche o strutturali senza macchia, preservando lo stato molecolare nativo.
Queste innovazioni sono dettagliate nelle recensioni recenti, come ] un riassunto completo delle applicazioni LCM nella ricerca sul cancro pubblicato in PMC[.
Conclusioni
La sua capacità di combinare la guida morfologica con un preciso recupero senza contaminazione ha sbloccato scoperte nella genomica del cancro, nella neuroscienze e oltre. Mentre sfide come la conservazione del RNA e i bassi rendimenti richiedono un'attenta ottimizzazione del protocollo, la tecnica continua a maturare, con l'automazione e l'integrazione di omiscupati spaziali che espande la sua utilità.