Hydrogels als extracellulaire matrixmics in driedimensionale celcultuur

Driedimensionale (3D) celcultuur is een essentieel instrument geworden in het moderne biomedisch onderzoek omdat het de belangrijkste aspecten van de in vivo microomgeving hervat. In het hart van deze revolutie zijn hydrogels .. water-wollen polymeernetwerken die kunnen worden ontworpen om de inheemse extracellulaire matrix (ECM) nauw te imiteren. In dit artikel worden de principes, types en toepassingen van hydrogels onderzocht zoals ECM nabootst, worden hun voordelen en huidige beperkingen besproken en worden nieuwe strategieën belicht die het veld verplaatsen naar meer fysiologische relevante modellen.

De extracellulaire matrix: Een dynamische steiger

In levende weefsels, cellen zijn ingebed in de ECM . . een complex, driedimensionale netwerk van eiwitten, glycoproteïnen en polysacchariden. De ECM biedt niet alleen structurele ondersteuning, maar ook biochemische en mechanische signalen die celadhesie, migratie, proliferatie, differentiatie en overleving reguleren. Belangrijkste componenten zijn collageen, fibronectine, laminine, elastine, en glycosaminoglycanen zoals hyaluronzuur. Het ECM wordt voortdurend geremodelleerd door enzymen zoals matrix metalloproteïnases (MMPs) en is uniek voor elk weefseltype in termen van samenstelling, stijfheid en porositeit.

Traditionele tweedimensionale (2D) monolaagse culturen dwingen cellen op een stijf, vlak substraat dat weinig lijkt op deze natuurlijke 3D-omgeving. Cellen op plastic of glas vertonen abnormale morfologie, gewijzigde genexpressie en verlies van weefselspecifieke functies. Hydrogels overwinnen deze beperkingen door een gehydrateerde 3D steiger te leveren die afgestemd kan worden op de fysische en chemische eigenschappen van de inheemse ECM.

Wat zijn Hydrogels?

Hydrogels zijn onderling verbonden netwerken van hydrofiele polymeren die grote hoeveelheden water kunnen absorberen en behouden . Vaak 90/99% van hun totale gewicht. Dit hoge watergehalte geeft hen een zachte, weefselachtige consistentie. De crosslinks kunnen fysiek (bijvoorbeeld waterstofbindingen, ionische interacties, ketenverstrengelingen) of chemische (covalente bindingen) zijn en het resulterende netwerk kan worden ontworpen om te degraderen of stabiel te blijven.

Omdat hydrogels zeer doorlaatbaar zijn voor zuurstof, voedingsstoffen en metabole afvalstoffen, kunnen ze de levensvatbaarheid van cellen gedurende de 3D-constructie ondersteunen. Ze kunnen ook worden gefunctionaliseerd met hechtingsliganden (bijv. RGD-peptiden), groeifactoren of andere bioactieve moleculen om celgedrag te sturen. Deze eigenschappen maken hydrogels tot de meest gebruikte klasse van biomaterialen voor het bouwen van 3D-celculturen.

Soorten Hydrogels gebruikt om Native ECM na te bootsen

natuurlijke hydrogels

Natuurlijke hydrogels zijn afgeleid van biologische bronnen en bevatten vaak intrinsieke bioactieve motieven die cellen herkennen.

  • Collagen type I . . . de meest voorkomende eiwit in zoogdieren, die uitgebreid worden gebruikt voor 3D cultuur van fibroblasten, kankercellen en stamcellen. Cellen kunnen samentrekken en collageengels verbouwen, waardoor ze zeer dynamisch zijn.
  • Gelatin ..gepareerd collageen, vaak methacrylaat (GelMA) voor fotocrosslinking. Gelatin behoudt celbindende motieven en MMP-gevoelige plaatsen.
  • Matrigel . een kelder-membrane extract van Engelbreth-Holm-Swarm muissarcoom. Het bevat laminine, collageen IV, entactine en groeifactoren. Matrigel wordt op grote schaal gebruikt voor organoid kweek en angiogenese testen, maar de dierlijke oorsprong introduceert batch-tot-batch variabiliteit.
  • Hyaluronzuur (HA)
  • Alginaat .. een polysaccharide van zeewier dat ionisch gekruiste gels vormt met calcium. Alginaat is biocompatibel maar bevat geen celbindingsplaatsen van zoogdieren; het wordt vaak gemengd met andere biopolymeren.
  • Fibrin

Natuurlijke hydrogels hercapituleren de biochemische complexiteit van inheemse ECM, maar ze lijden aan beperkte tonijnbaarheid van mechanische eigenschappen en potentiële immunogeniciteit of besmetting.

synthetische hydrogels

Synthetische hydrogels worden vervaardigd uit synthetische polymeren met een duidelijke chemie. Hun eigenschappen kunnen nauwkeurig worden gecontroleerd en ze bieden superieure reproduceerbaarheid. Belangrijke klassen zijn:

  • Poly(ethyleenglycol) (PEG) . . het meest voorkomende synthetische hydrogelplatform. PEG is biologisch inert, dus moet het worden gefunctionaliseerd met adhesiepeptiden en gekruist via klikchemie, thiol-eenreacties, of acrylaat fotopolymerisatie. PEG hydrogels zijn zeer aanpasbaar.
  • Poly(vinylalcohol) (PVA)
  • Poly(2-hydroxyethylmethacrylaat) (PHEMA)
  • Poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAm)
  • Zelfassemblage-peptiden . .korte synthetische peptiden die β-sheet nanofibers vormen onder fysiologische omstandigheden, waardoor een hydrogel ontstaat die de vezelige ECM-structuur nabootst.

Synthetische hydrogels elimineren veel onzekerheden van natuurlijke materialen, maar ze missen de intrinsieke bioactiviteit die nodig is voor vele celtypes. Daarom worden hybride systemen die synthetische backbones combineren met bioactieve functionalisering steeds populairder.

Sleuteleigenschappen van hydrogels voor ECM Mimicry

Mechanische eigenschappen

De cellen voelen en reageren op de stijfheid van hun omringende matrix door middel van mechaniotransductie. Hydrogels kunnen worden geformuleerd om een breed scala van elastische mouli .. van zachte hersenweefsel (~ 0.1

Porositeit en permeabiliteit

Een ideale ECM-imitatie maakt een efficiënte diffusie van zuurstof, voedingsstoffen en afvalproducten mogelijk. Poresegrootte, interconnectiviteit en maaswijdte bepalen transportsnelheden. Synthetische hydrogels kunnen worden ontworpen met gecontroleerde porositeit met behulp van technieken zoals vriesdrogen, zoutuitspoeling of elektrospinning. In sommige gevallen wordt macro-porositeit (>100 μm) geïntroduceerd om celmigratie en vascularisatie mogelijk te maken.

Bioactiviteit en degradeerbaarheid

Om celfuncties te ondersteunen, moeten hydrogels hechtliganden (bv. RGD, YIGSR, IKVAV) en groeifactorbindende locaties presenteren. Ze moeten ook afbreekbaar zijn via cel-afscheidingsenzymen (MMP-gevoelige kruislinks) of door overlap ..zodat cellen de matrix kunnen hermodelleren, migreren en hun eigen ECM kunnen deponeren.

Viscoelasticiteit

Native ECM is niet puur elastisch; het vertoont viscoelastisch gedrag .. tijdafhankelijke stress ontspanning en kruip. Recente studies tonen aan dat viscoelastische hydrogels de cel verspreiding en proliferatie effectiever dan zuiver elastische hydrogels van dezelfde stijfheid bevorderen. Ontwerp van hydrogels die de stress-relaxatie eigenschappen van specifieke weefsels nabootsen is een actief gebied van onderzoek.

Voordelen van Hydrogels over 2D Cultuur

  • Fysiologische morfologie: Cellen in 3D hydrogels nemen in vivo-achtige vormen (bijvoorbeeld afgerond voor mesenchymale stamcellen, langwerpig voor fibroblasten) in plaats van afgeplatte, verspreide morfologieën gezien op plastic.
  • Verbeterde differentiatie: Stamcellen ontvangen juiste mechanische en biochemische signalen. Bijvoorbeeld, neurale stamvaders onderscheiden zich efficiënter in neuronen in zachte hydrogels dan in 2D.
  • Cell-cel- en celmatrixinteracties: 3D-culturen maken natuurlijk contact mogelijk tussen cellen en met de matrix, wat leidt tot vorming van aanhangerskruisingen en kloofknooppunten.
  • Drugresponsvoorspelling: Kankercellen in 3D hydrogels vertonen een grotere resistentie tegen chemotherapeutische middelen in vergelijking met 2D monolagen, die in vivo geneesmiddelgevoeligheid nader nabootsen.
  • Langdurende cultuur: Hydrogels kunnen weken of maanden levensvatbare culturen behouden, terwijl 2D-culturen vaak samenvloeiend en senescent worden binnen dagen.

Toepassingen van 3D-culturen op Hydrogel-basis

Weefsel Engineering en regeneratieve geneeskunde

Hydrogels worden gebruikt als steigers om cellen in beschadigde weefsels te leveren. Bijvoorbeeld, injecteerbare hydrogels gevuld met chondrocyten of mesenchymale stamcellen worden gebruikt voor kraakbeenherstel. Gelatine-gebaseerde hydrogels geladen met osteogene factoren bevorderen botregeneratie. Fibrin hydrogels met dermale fibroblasten versnellen wondgenezing. De sleutel is om de afbraaksnelheid van de hydrogel te koppelen aan de snelheid van nieuwe weefselvorming.

Organoïde en Spheroïde Cultuur

Stamcellen in Matrigel of synthetische hydrogels zelf-organiseren in organoids . . miniatuur organen die de architectuur en functie van weefsels zoals darm, hersenen, lever en nieren hercapituleren. Hydrogels bieden de fysieke ondersteuning en biochemische gradiënten die nodig zijn voor zelforganisatie. Recente werkzaamheden hebben volledig gedefinieerde synthetische hydrogels voor organoid cultuur ontwikkeld, waardoor het vertrouwen op slecht gedefinieerde dierlijke extracten wordt verminderd.

Modellering van ziekten en geneesmiddelenscreening

Van patiënten afgeleide tumorcellen die in hydrogels worden gekweekt, vormen tumorsferoïden of van patiënten afgeleide organoïden die de heterogeniteit van de oorspronkelijke kanker behouden. Deze modellen worden gebruikt voor hoge doorvoer van geneesmiddelen en gepersonaliseerde geneeskunde. Hydrogels kunnen ook worden gebruikt om het fibrotische ECM na te bootsen van ziekten zoals levercirrose of longfibrose, waardoor platforms worden aangeboden om antifibrotische verbindingen te testen.

Angiogenese- en vaatverteringsstudies

Endotheliale cellen gekweekt in collageen of fibrine hydrogels vormen capillaire-achtige netwerken wanneer gestimuleerd met angiogene factoren. Deze modellen worden gebruikt om tumor angiogenese, wondgenezing en anti-angiogene geneesmiddel effectiviteit te bestuderen. Incorporatie van pericyten of gladde spiercellen maakt de bouw van meer volwassen, functionele vasculatuur mogelijk.

Bioprinting

Hydrogels die op een ruimtelijke wijze kunnen worden gecrosslinked (bv. fotocrosslinkable GelMA of PEG‐diacrylaat) zijn de primaire inkten voor het extruderen op basis van 3D bioprinten. Gedrukte constructies kunnen meerdere celtypes bevatten die in anatomisch relevante patronen zijn gerangschikt. De uitdaging blijft om grote constructies met voldoende mechanische stabiliteit en vascularisatie af te drukken om levensvatbaarheid te behouden.

Voor een uitgebreide herziening van hydrogeltoepassingen, zie Nature Reviews Materials (2020).

Beperkingen en uitdagingen

Ondanks hun successen, worden hydrogels geconfronteerd met verschillende hindernissen voor wijdverspreide klinische vertaling:

  • Mechanische sterkte: De meeste hydrogels zijn mechanisch zwak en kunnen worden gescheurd of gecomprimeerd tijdens het hanteren. Hybride hydrogels met interpernetrating netwerken of versterking met nanodeeltjes worden ontwikkeld.
  • Degradatiecontrole: Natuurlijke hydrogels degraderen vaak te snel of onvoorspelbaar. Synthetische hydrogels kunnen worden ontworpen met gecontroleerde afbraaksnelheden, maar de bijproducten moeten niet giftig zijn.
  • Veranderlijkheid van de slag: Matrigel en andere van dieren afgeleide hydrogels hebben te lijden van veel-tot-lot verschillen, die reproduceerbaarheid in gevaar brengen. Het veld beweegt zich naar chemisch gedefinieerde, xeno-vrije hydrogels.
  • Immunerespons: Geïmplanteerde hydrogels kunnen vreemde lichaamsreacties veroorzaken, waaronder ontsteking, fibrose en inkapseling. Strategieën om dit te verzachten zijn onder meer het gebruik van ultra-lage vuilingsmiddelen en het opnemen van anti-inflammatoire middelen.
  • Vascularisatie: Dikke constructies ( > 200 μm) vereisen een functionele bloedtoevoer om necrose te voorkomen. Prevascularisatie, microfluïdica en opname van angiogene factoren zijn actieve onderzoeksgebieden.
  • Opschaling en reproduceerbaarheid: Het vertalen van een laboratorium-hydrogel naar een GMP-conforme product vereist een strenge kwaliteitscontrole van grondstoffen, kruiskoppeling en celzaaiing.

Toekomstige richtsnoeren en opkomende strategieën

Slimme en Stimuli-responsieve hydrogels

Hydrogels die reageren op pH, temperatuur, licht, enzymen of magnetische velden kunnen dynamische controle over de cellulaire microomgeving. Zo kunnen hydrogels die stijf worden bij blootstelling aan blauw licht onderzoekers bestuderen hoe cellen reageren op geleidelijke mechanische veranderingen. Enzyme-responsieve hydrogels die groeifactoren alleen vrijgeven wanneer MMP-activiteit hoog is, worden ontwikkeld voor weefselregeneratie.

Gedecellulariseerde ECM Hydrogels

Hele organen of weefsels (bijvoorbeeld hart, long, lever) kunnen worden gedecellulariseerd om cellulaire componenten te verwijderen met behoud van de inheemse ECM. Het resulterende ECM is solubilised en kan worden gereconstitueerd in een hydrogel. Deze zogenaamde deCM hydrogels bevatten het volledige repertoire van weefselspecifieke ECM-eiwitten, glycosaminoglycanen en groeifactoren, zodat de meest authentieke nabootsing mogelijk is.

Integratie met microfluïdica en Organ‐on‐Chip

Hydrogels worden in microfluïdische apparaten ingebouwd om orgaan-on-chip systemen te creëren die de 3D-cultuur doordrenkt met voedingsstoffen en afval verwijderen. Deze combinatie maakt de langetermijncultuur van primaire menselijke cellen mogelijk en maakt studies mogelijk van het metabolisme, transport en toxiciteit onder stroomomstandigheden. Bedrijven zoals Emulate en Mimetas hebben dergelijke platforms in de handel gebracht.

Geavanceerd Hydrogel ontwerp met machine learning

Hoge-doorvoer screening van hydrogel bibliotheken . . verschillende polymeer samenstelling, crosslinker type, stijfheid, en degradeerbaarheid . . Het genereren van grote datasets. Machine learning algoritmes kunnen de formulering die het beste een bepaald celtype of functie ondersteunt voorspellen, waardoor het aantal trial-and-error experimenten drastisch wordt verminderd.

Klinische vertaling van Hydrogel-gebaseerde therapieën

Verschillende hydrogelproducten hebben een regelgevende goedkeuring gekregen, waaronder Hyalgan (hyaluronzuur voor osteoartritis), Tissel (fibrine sealant), en DuraSeal (PEG-gebaseerde dural sealant). Toekomstige producten zullen waarschijnlijk hydrogels combineren met cellen of biologische producten voor kraakbeenherstel, hartvlekken en wondgenezing. Het belangrijkste bottleneck toont veiligheid en werkzaamheid op lange termijn bij grote diermodellen en mensen.

Zie Bioactieve materialen (2020) voor meer informatie over klinische toepassingen.

Conclusie

Hydrogels zijn verder gegaan dan eenvoudige cel-embedden matrices om hoog ontwikkelde platforms te worden die de moleculaire, mechanische en structurele complexiteit van inheemse ECM hercapituleren. Natuurlijke hydrogels bieden bioactiviteit, synthetische hydrogels bieden tonijnbaarheid, en hybride benaderingen combineren het beste van beide werelden. Huidige toepassingen span weefsel engineering, organoid biologie, drug ontdekking en bioprinting. Doorlopende vooruitgang in stimuli-responsieve materialen, gedecellulaire ECM hydrogels, microfluidics, en machine learning zijn klaar om bestaande beperkingen te overwinnen en de klinische toepassing van 3D hydrogel gebaseerde technologieën te versnellen.