Vascular células musculares lisas são a chave para vasos sanguíneos funcional

As doenças cardiovasculares continuam a ser a principal causa de morte em todo o mundo, conduzindo uma demanda persistente de enxertos vasculares. Enquanto os vasos autólogos como a veia safena são o padrão ouro para cirurgia de bypass, muitos pacientes não possuem tecido doador adequado devido à colheita prévia, doença ou limitações anatômicas.Os enxertos sintéticos feitos de Dacron ou ePTFE funcionam bem para artérias de grande diâmetro, mas falham em aplicações de pequeno diâmetro (menos de 6 mm) devido à trombose e hiperplasia intimal.Os vasos sanguíneos de engenharia tissular (TEBVs) oferecem uma alternativa convincente, combinando andaimes biodegradáveis com células vivas para criar construtos que podem crescer, remodelar e integrar-se com o hospedeiro.Entre os componentes celulares de um vaso projetado, as células musculares lisas vasculares (VMS) destacam-se como os determinantes primários de força mecânica, função contrátil e patencia de longo prazo. Entendendo a biologia multifacetada de CVMs e traduzindo que o conhecimento em estratégias de engenharia robustas é essencial para a movimentação de TEBVs desde o laboratório até a sala de operação.

O que são células musculares lisas Vasculares?

Os CMLV são células musculares altamente especializadas e não estriadas que residem na camada média das artérias e veias. Nos vasos nativos, existem em fenótipo contrátil quiescente, caracterizado por proteínas contráteis abundantes, como a actina α-smooth muscular (α-SMA), cadeia pesada de miosina muscular lisa (SM-MHC) e calponina. Estas células respondem às forças hemodinâmicas e sinais neuro-humorais, contraindo-se e relaxando para regular o diâmetro dos vasos, pressão arterial e fluxo sanguíneo regional. No entanto, os CVMVM não são terminalmente diferenciados; mantêm uma plasticidade fenotípica notável. Em resposta a lesões, fatores de crescimento ou alterações na matriz extracelular (MCE), podem mudar para um fenótipo sintético ou proliferativo, regulando marcadores contráteis e regulando a produção de MCE, metaloproteinases matriciais e proteínas promigratórias. Esta plasticidade é essencial para o desenvolvimento, reparação e remodelação dos vasos, mas também representa um grande desafio na engenharia de tecidos: manutenção do fenótipo desejado ao longo do tempo.

Além da contratilidade e síntese de MCE, os CMVE também servem como barreira crítica, que auxiliam na regulação da passagem de macromoléculas e células através da parede do vaso, contribuem para a produção de fibras elásticas que proporcionam recolhimento e interagem com células endoteliais por meio de sinalização paracrina para manter a homeostase vascular.Em TEBVs de pequeno diâmetro, uma camada funcional de MCEV é, muitas vezes, a diferença entre um enxerto que permanece aberto e um enxerto que falha devido a trombose ou aneurisma.

O papel crítico dos CVM em vasos sanguíneos projetados

Num vaso sanguíneo de engenharia de tecidos, os CMV não são apenas células de enchimento. São os arquitectos das propriedades mecânicas e biológicas da parede do vaso. Os seus papéis podem ser divididos em várias funções inter-relacionadas.

Contratilidade e Vasoreatividade

Uma das principais vantagens dos TEBV vivos sobre enxertos sintéticos é sua capacidade de regular ativamente o fluxo sanguíneo. Quando adequadamente diferenciados, os CMVs na parede projetada podem contrair-se em resposta a agonistas como endotelina-1, angiotensina II e cloreto de potássio, e relaxar em resposta ao óxido nítrico ou prostaciclina. Essa vasorreatividade ajuda a corresponder à perfusão à demanda tecidual e amortece a pressão de pulso, reduzindo o risco de dano aos órgãos a jusante. Os pesquisadores frequentemente medem a força contrátil dos vasos projetados em biorreatores por perfusão com agentes vasoativos e alterações no diâmetro de rastreamento.

Apoio estrutural e produção de ECM

A força mecânica de um vaso sanguíneo vem principalmente do ECM secretado por VSMCs. Colágeno tipo I e III fornecem resistência à tração, enquanto a elastina dá ao vaso seu recolhimento elástico. Em construções projetadas, os VSMCs são semeados em um andaime – muitas vezes um polímero biodegradável como a policaprolactona (PCL), ácido poliglicólico (PGA), ou uma matriz descelularizada – e então cultivadas em condições dinâmicas. Ao longo de semanas a meses, os VSMCs degradam o andaime e o substituem por seu próprio ECM. O construto resultante pode desenvolver pressões de ruptura superiores a 2000 mmHg e a adesão que se aproximam das artérias nativas. Sem uma população robusta de VSMC, a parede do vaso permanece fina e propensa a aneurisma ou ruptura.

Cura, Integração e Remodelação

Após a implantação, um TEBV é submetido a lesão e inflamação. As células imunes derivadas do hospedeiro infiltram-se na parede, e células progenitoras circulantes podem enxertar. Os VSMCs no construto podem proliferar e migrar para repovoar áreas de perda celular, e produzem matriz para reparar microtears. Ao longo do tempo, o vaso projetado remodela-se para assemelhar-se a uma artéria nativa, com VSMCs alinhando circunferencialmente e expressando marcadores contráteis maduros. Este processo de remodelação é essencial para a patença de longo prazo e é um dos argumentos mais convincentes para o uso de células vivas em vez de um andaime acelular.

Inibição da Trombose e Hiperplasia Intimal

Uma camada funcional de CMV também contribui para as propriedades antitrombóticas da parede do vaso. Os CMVs contráteis produzem trombomodulina e inibidor da via do fator tecidual, e mantêm uma superfície não trombogênica quando a camada endotelial está intacta. Nos casos em que o endotélio está danificado ou ausente – comum em sítios anastomóticos – os CMVs subjacentes podem ajudar a limitar a ativação plaquetária e a formação de trombos. Além disso, os CMVs que permanecem em um fenótipo quiescente são menos propensos a contribuir para a hiperplasia neointimal, a proliferação anormal de células musculares lisas que leva à falência do enxerto. Estratégias de engenharia que promovem um fenótipo de CMV contrátil estável são, portanto, fundamentais para prevenir tanto a trombose quanto a hiperplasia.

Fontes de VSMCs para Engenharia de Tecidos

A escolha da fonte de CMV afeta dramaticamente o desempenho do construto final, com vantagens e limitações que devem ser pesadas em relação ao alvo clínico.

VSMCs arteriais primários

A fonte mais simples é a CMLV primária isolada de artérias doadoras (por exemplo, de restos de artéria torácica interna ou veia safena própria do paciente). Estas células já estão comprometidas com a linhagem muscular lisa e podem ser expandidas em cultura. No entanto, eles têm uma vida útil finita replicativa e podem sofrer deriva fenotípica em direção ao estado sintético durante a expansão. Para uso autólogo, a colheita de um vaso doador é invasiva e pode ser impraticável em pacientes com doença vascular. Fontes alogênicas correm o risco de rejeição imunológica, a menos que o receptor seja imunossuprimido ou as células sejam projetadas para fugir do sistema imunológico.

VSMCs Derivados de Células-tronco

As células estaminais podem ser orientadas para um destino muscular liso utilizando protocolos que envolvem factores de crescimento como PDGF-BB, TGF-β1, e activa A. As células semelhantes a VSMC resultantes expressam marcadores contráteis e podem contrair-se in vitro. As células estaminais mesenquimais (CTMs) derivadas da medula óssea, tecido adiposo ou cordão umbilical também se diferenciam em células musculares lisas sob condições apropriadas e têm a vantagem de propriedades imunomodulatórias. No entanto, a eficiência de diferenciação e a estabilidade fenotípica das CTM derivadas de células estaminais permanecem áreas de investigação activa. A diferenciação off-target e a tumorigenicidade (no caso de CPMi) devem ser cuidadosamente controladas.

VSMCs induzidos através de reprogramação direta

Uma abordagem emergente é a conversão direta de fibroblastos ou outras células somáticas em CMVs usando fatores de transcrição específicos da linhagem, como MYOCD (miocardina) e SRF. Este método evita o estágio pluripotente e pode gerar uma população mais homogênea. Estudos iniciais mostram que CMVs reprogramados podem contribuir para a formação de vasos in vivo, mas o campo ainda é pré-clínico.

Estratégias de Design e Cultura de Andaimes

Para aproveitar todo o potencial dos VSMCs, o andaime deve fornecer suporte mecânico adequado, pistas bioquímicas e uma taxa de degradação que corresponda à deposição de ECM. São utilizadas três grandes categorias de andaime.

Andaimes naturais

Os hidrogéis de colágeno, fibrina e ácido hialurônico oferecem excelentes biocompatibilidades e sítios de adesão celular. Os CMVs incorporados nesses géis podem remodelá-los, mas a resistência mecânica inicial é baixa. A fibrina tem sido utilizada com sucesso em vários modelos de TEBV, incluindo as chamadas folhas de vasos “automontadas”, onde os CMVs são cultivados em um gel de fibrina que eles gradualmente substituem por ECM. O processo leva semanas e requer um biorreator para aplicar estiramento cíclico, que reregula a elastina e síntese de colágeno.

Polímeros biodegradáveis sintéticos

Polímeros como PCL, PGA, ácido poliláctico (PLA) e ácido poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) podem ser eletroespún em malhas nanofibrosas que mimetizam a arquitetura da ECM nativa. Estes andaimes fornecem resistência mecânica imediata e podem ser adaptados para se degradar ao longo de semanas a meses. VSMCs semeados sobre estes andaimes anexam, proliferam e depositam ECM. Um desafio chave é alcançar distribuição uniforme de células em toda a espessura da parede, especialmente em comprimentos de vasos clinicamente relevantes (5-20 cm).

Matrizes descelularizadas

Os vasos humanos ou animais descelularizados mantêm a arquitetura e composição da ECM nativa, incluindo colágeno, elastina e glicosaminoglicanos. Após a remoção dos antígenos celulares, estes scaffolds podem ser recelularizados com células VSMC (e endoteliais) para produzir um vaso “híbrido”. O vaso recelularizado apresenta muitas vezes excelentes propriedades mecânicas e vasorreatividade, mas o processo de descelularização pode danificar componentes da ECM, e a remoção completa de epítopes imunogênicos de fontes xenogênicas é difícil.

Condicionamento mecânico em Bioreatores

Independentemente do tipo de scaffold, a cultura dinâmica é quase sempre necessária para produzir um TEBV funcional. Os biorreatores aplicam fluxo pulsátil e alongamento circunferencial cíclico, que mimetizam o ambiente hemodinâmico de uma artéria nativa. Forças mecânicas ativam vias de sinalização (por exemplo, RhoA/ROCK, mecanotransdução mediada por integrina) que promovem o fenótipo contrátil VSMC e estimulam o alinhamento e a ligação cruzada da ECM. Protocolos típicos envolvem perfusão de baixo fluxo na primeira semana para permitir a fixação celular, seguido de aumento do fluxo e pressão ao longo de 4-8 semanas. O resultado é um vaso que pode ser implantado cirurgicamente e permanecer patente.

Desafios atuais em navios de engenharia baseados em VSMC

Apesar de avanços significativos, vários obstáculos impedem o uso clínico generalizado de TEBVs.

Estabilidade do Fenótipo

O maior desafio é manter um fenótipo contratilo de CMV desde o momento da semeadura até a vida do implante. Em cultura estática, os CMVs mudam rapidamente para um estado sintético e produzem matriz excessiva que pode ocluir o lúmen (hiperplasia neointimal). Uma vez implantado, o vaso é exposto a um complexo, meio inflamatório que pode conduzir ainda mais a mudança fenotípica. Estratégias para estabilizar o fenótipo contrátil incluem o uso de meios quimicamente definidos (baixo soro, adição de heparina ou TGF-β), pré-condicionamento mecânico e co-cultura com células endoteliais, que liberam óxido nítrico que ajuda a manter os CMVs quiescentes.

Resposta imunitária

Os VSMCs alogénicos ou xenogénicos irão desencadear uma resposta imunitária a menos que o hospedeiro seja imunossuprimido. Mesmo os VSMCs autólogos podem provocar inflamação se forem modificados (por exemplo, por edição genética) ou se o material do andaime for imunogénico. Os andaimes descelularizados evitam antígenos associados às células, mas não têm o componente VSMC vivo. Alguns grupos estão a explorar os VSMCs “dadores universais” projetados para expressar moléculas imuno-evasivas, como HLA-E ou PD-L1, mas este trabalho está em fases iniciais.

Difusão Nutriente e Sobrevivência Celular

Em vasos de paredes grossas (maior que 200-300 μm), o oxigênio e nutrientes não podem chegar ao interior dos CMVs por difusão isolada. Sem uma microvasculatura funcional, as células no centro da parede podem morrer durante a cultura ou após a implantação. Estratégias para superar isso incluem a co-cultura com células endoteliais que formam redes capilares, usando andaimes geradores de oxigênio, ou criando um andaime poroso que permite uma rápida vascularização do hospedeiro. Alguns grupos estão investigando enxertos de vasos de pequeno diâmetro com canais pré-formados que promovem o crescimento do vaso hospedeiro.

Escalabilidade e Fabricação

A produção de um TEBV que atenda às normas regulatórias requer um processo de fabricação reprodutível e rentável. Os métodos atuais envolvem muitas vezes semanas de expansão celular e cultura de biorreator, com etapas manuais que são intensivas e propensas à variabilidade.O desenvolvimento de biorreatores de sistema fechado, semeadura automatizada de células e ensaios de controle de qualidade (por exemplo, para a expressão de marcadores contráteis, pressão de ruptura) será essencial para traduzir TEBVs para a produção comercial.

Orientações e Inovações futuras

Várias tecnologias emergentes prometem enfrentar os desafios descritos acima.

Edição de Genes para o Controle de Fenótipos

Ferramentas baseadas em CRISPR podem ser usadas para projetar VSMCs que são resistentes à mudança fenotípica ou que superexpressam proteínas contráteis. Por exemplo, bater em um transgene de miocardina constitutivamente ativo ou excluir KLF4 (um fator de transcrição que impulsiona o fenótipo sintético) poderia bloquear VSMCs em um estado contrátil. Da mesma forma, a edição de genes pode produzir células que evitam o reconhecimento imunológico ou que expressam fatores pró-angiogênicos para promover a integração do hospedeiro.

Bioimpressão 3D

A bioimpressão permite um controle espacial preciso sobre a distribuição celular, composição de andaimes e até mesmo a orientação de fibras impressas. Impressoras multiaxiais de jato de tinta ou extrusão podem depositar camadas de hidrogéis VSMC carregados de polímeros, conchas e células endoteliais para construir um vaso com geometria definida. Vários grupos imprimiram artérias de pequeno calibre com lumens abertos e demonstraram respostas contráteis após a cultura. O desafio é alcançar a resistência mecânica necessária para implantação, mas a coimpressão com polímeros biodegradáveis pode fornecer uma solução.

Organóides e Embarcações Automontadas

Uma alternativa para abordagens baseadas em andaimes é permitir que os CMVV se auto-organizam em uma estrutura de vasos. Ao cultivar CVMVs em um mandril tubular em um meio definido, alguns grupos produziram vasos acelulares suficientemente robustos para implantação após a descelularização. Outros criaram “organóides musculares suaves” que exibem atividade contrátil espontânea e podem ser usados para estudar doenças vasculares ou testar respostas medicamentosas.

Tradução Clínica e Ensaios em andamento

Várias plataformas de TEBV entraram em testes clínicos.O mais avançado é o enxerto “Lifeline” (CytoGraft, agora parte de Humacyte), que usa CMVs alogênicos semeados em um andaime biodegradável em um biorreator, então decelularizado antes da implantação. Este enxerto acelular contém uma ECM rica produzida por CMVs, mas evita imunogenicidade de células vivas. Ensaios clínicos precoces em acesso à hemodiálise e doença arterial periférica têm mostrado promessa, com taxas de patencia aproximando-se dos enxertos de veia autóloga em alguns estudos. Outros grupos estão explorando enxertos totalmente vivos com células autólogas, embora estes requerem fabricação mais específica do paciente.

Para mais informações, consulte esta revisão da regulação do fenótipo do VSMC e este estudo de natureza Análises Cardiologia visão geral dos enxertos vasculares de tecidos. Detalhes adicionais sobre os materiais de andaimes podem ser encontrados neste artigo sobre Biomateriais.

Conclusão

As células musculares lisas vasculares são muito mais do que um enchimento estrutural em vasos sanguíneos projetados. Fornecem a função contrátil que faz um enxerto responsivo às demandas hemodinâmicas, construir e manter a matriz extracelular que confere ao vaso sua integridade mecânica, e participar na cicatrização e remodelação após a implantação. A tradução bem sucedida de TEBVs para a clínica depende de nossa capacidade de gerar VSMCs de forma confiável, manter seu fenótipo desejado ao longo da cultura e pós-implantação, e scaffolds de design que suportam sua função. Com avanços na biologia de células-tronco, edição de genes, desenho de biorreators e bioimpressão 3D, o objetivo de produzir enxertos vasculares de pequeno diâmetro, duráveis, duradouros, está se movendo mais próximo da realidade. À medida que o campo continua a amadurecer, o papel dos VSMCs permanecerá central para cada avanço.