Влияние генного проектирования на пути биохимического производства

Генетический дизайн цепи: проект биохимического производства следующего поколения

В последнее десятилетие синтетическая биология вышла за рамки экспериментов с доказательством концепции в подлинную производственную дисциплину. В основе этой трансформации лежит генетическая схема проектирования — преднамеренное построение искусственных генных сетей, которые направляют клеточное поведение с предсказуемой точностью. Эти схемы оказывают прямое, измеримое влияние на биохимические пути производства , трансформируя то, как мы делаем все, от лекарств от малярии до возобновляемых видов топлива. Рассматривая живые клетки как программируемые фабрики, исследователи могут набирать урожайность, отключать расточительные побочные реакции и поддерживать стабильное производство даже при изменении условий. В этой статье исследуются основные принципы генетической схемы проектирования, ее реальное влияние на биохимическое производство и новые технологии, которые обещают изменить область.

Что такое генетические цепи?

Генетические схемы представляют собой наборы последовательностей ДНК, обычно включающие промоторы, кодирующие области, сайты связывания рибосом и терминаторы, которые вместе ведут себя как инженерная логическая система. Так же, как электронные схемы объединяют транзисторы, резисторы и провода для выполнения вычислений, генетические схемы используют регуляторные белки, индуцируемые промоторы и РНК-взаимодействия для вычисления входных сигналов (например, химический индуктор или сдвиг температуры) и производят желаемый выход экспрессии гена.

Простой пример — выключатель «включено»: промотор, который обычно подавляется, может быть выпущен путем добавления молекулы индуктора, что приводит к экспрессии целевого белка. Более сложные схемы включают в себя положительную и отрицательную петли обратной связи , мотивы подачи-передачи и несколько слоев регулирования. Изощренность этих конструкций непосредственно определяет, насколько эффективно микробный хозяин может быть принужден к производству конкретного биохимического вещества.

Основные компоненты, которые приводят в движение поведение цепи

Каждая генетическая цепь опирается на несколько стандартных частей. Понимание этих компонентов имеет важное значение для оценки того, как схема влияет на производственные пути:

Как дизайн цепи меняет пути биохимического производства

Связь между конструкцией схемы и биохимическим производством прямая: каждый фермент в пути находится под транскрипционным или трансляционным контролем, и этот контроль - то, что обеспечивает генетическая цепь.Тщательно организуя, когда и сколько каждого фермента сделано, инженеры могут достичь результатов, которые являются трудными или невозможными со статической, конститутивной экспрессией.

Повышение доходности за счет динамического регулирования

Одним из наиболее мощных применений генетических схем является динамическая регуляция уровней ферментов. Во многих естественных путях поток ограничен, потому что ранний фермент производит токсичный промежуточный, если он переэкспрессирован, или поздний фермент слишком медленный. Схема обратной связи может ощущать концентрацию промежуточного пути и соответствующим образом регулировать экспрессию вверх или вниз по течению. Например, схема, которая обнаруживает накопление малонил-CoA в пути производства жирных кислот, может снижать регуляцию собственного синтеза, чтобы предотвратить перелив, а затем регуляцию, когда уровни падают. Этот вид «метаболического переключения» непрерывно балансирует спрос и предложение, часто удваивая или утрояя конечные титры.

Сокращение отходов и побочных продуктов

Нежелательные побочные реакции являются основным источником неэффективности в промышленной ферментации. Генетические цепи могут быть развернуты на , чтобы заставить замолчать конкурирующие пути по требованию. Типичная конструкция использует репрессор, чувствительный к присутствию желаемого продукта, чтобы закрыть конкурирующий путь, когда продукт в изобилии. Когда продукт дефицитен, схема де-репрессирует конкурентный маршрут, позволяя клеткам отводить ресурсы обратно в биомассу. Это интеллектуальное распределение метаболических ресурсов уменьшает накопление побочных продуктов без необходимости добавления среды.

Повышение стабильности производства с течением времени

Промышленные биопроцессы часто работают в течение нескольких дней или недель. В течение этого времени клетки мутируют, промоторы могут быть заглушены эпигенетическими изменениями, а условия окружающей среды колеблются. Генетические цепи могут быть спроектированы так, чтобы быть ** устойчивыми к таким возмущениям **. К примеру, петля обратной связи с отрицательными обратными связями, которая поддерживает постоянную внутреннюю концентрацию ключевого регулятора, может буферизировать изменения числа копий плазмиды или доступности питательных веществ. Некоторые схемы включают «выключатель убийства», который останавливает производство, если датчик обнаруживает отклонение от желаемого состояния, предотвращая потерю партии.

Классические топологии цепей, используемые в производстве

Несколько канонических схем оказались особенно полезными в биохимическом производстве. Каждая топология обеспечивает уникальную возможность управления:

Переключатель Toggle

Первоначально разработанный Гарднером, Кантором и Коллинзом в 2000 году, переключатель переключения состоит из двух репрессивных промоторов, расположенных в петле взаимного подавления. Схема может существовать в одном из двух стабильных состояний (высокая экспрессия гена А, низкий ген В или наоборот). В производственном контексте переключатель может переключать клетку между состоянием «роста» (где ресурсы идут на биомассу) и состоянием «производства» (где ресурсы перетекают в соединение). Это разделение позволяет избежать компромисса между производством роста, который часто преследует метаболическую инженерию. Индуктор переворачивает переключатель после достижения достаточной биомассы, инициируя производство высокой урожайности.

Осциллятор (репрессилятор)

В то время как осцилляторы известны созданием периодических моделей экспрессии генов, они также имеют место в производстве. Создавая пульсативный выброс токсичного промежуточного вещества, осциллятор может предотвратить накопление промежуточного вещества до ингибирующих уровней, все еще приводя к высокому общему потоку. Например, при производстве предшественника химиотерапии паклитаксела репрессилятор может контролировать время действия фермента цитохрома P450, ограничивающего скорость, избегая клеточного стресса.

Фильтры Band-Pass

Схема полосового прохода активирует экспрессию только тогда, когда входная концентрация попадает в конкретное окно. Это особенно ценно для производственных путей, где промежуточная концентрация должна поддерживаться в узком оптимальном диапазоне. Если промежуточная концентрация идет слишком высоко, схема уменьшает экспрессию нисходящего фермента; если она падает слишком низко, экспрессия увеличивается. Этот гомеостатический контроль был продемонстрирован в E. coli для производства мевалоната и изопропанола.

Реальные примеры производства, управляемого цепями

Артемизиновая кислота (прекурсор лекарств от малярии)

Производство артемизиновой кислоты в искусственных дрожжах было одним из первых блокбастерных успехов синтетической биологии. Хотя первоначально не полагались на сложные синтетические схемы, более поздние улучшения использовали динамическую систему регулятора датчиков для управления потоком через мевалонатный путь. Схема, которая ощущает накопление фарнезилпирофосфата и набирает обратно восходящий путь, одновременно повышая выходной фермент, привела к 50% увеличению урожайности и уменьшила потребность в дорогостоящих режимах питания.

Биотопливо: этанол и усовершенствованный бутанол

Для биоэтанола простая конститутивная сверхэкспрессия ферментов, продуцирующих этанол, работает достаточно хорошо, но для продвинутых биотоплива, таких как изобутанол, токсичность является основным препятствием. Исследователи использовали схему, которая ощущает мембранный стресс, вызванный накоплением изобутанола, и одновременно активирует эффлюксные насосы, в то время как понижающие регуляции ферменты в производственном пути, чтобы избежать перегрузки клетки. Этот контроль обратной связи позволил титрам изобутанола превышать 30 г / л в штамме, который в противном случае погиб бы на половине этого уровня.

Специальные химические вещества: Нарингенин и ресвератрол

Растительные полифенолы, такие как нарингенин и ресвератрол, имеют нутрицевтическую ценность, но производятся в низких урожаях микробными хозяевами из-за конкурирующих требований к предшественнику малонил-CoA. Генетическая схема, которая регулирует синтез малонил-CoA, когда концентрация продукта низкая, и отключает его, когда продукт накапливается, улучшила титры ресвератрола в три раза в E. coli .

Проблемы контекстной зависимости

Несмотря на значительный прогресс, генетическая схема конструкции по-прежнему затруднена контекстной зависимостью . Схема, которая отлично работает в одном штамме хозяина или одном генетическом фоне, может выйти из строя в другом из-за различий в эндогенных факторах транскрипции, доступности РНК-полимеразы или метаболической нагрузке. Кроме того, части, используемые в схеме, не являются действительно модульными - прочность промотора может изменяться в зависимости от соседних последовательностей ДНК, и сайты связывания рибосом ведут себя по-разному, когда размещены рядом с различными стартовыми кодонами.

Для решения этой проблемы в этой области были разработаны стандартизированные библиотеки деталей (например, коллекция промоутеров Anderson, реестр iGEM) и вычислительные инструменты, которые предсказывают поведение деталей. Тем не менее, абсолютная предсказуемость остается неуловимой. В результате большинство успешных производственных цепей по-прежнему строятся с обширным итеративным тестированием: строительство → тестирование → модель → редизайн. Принятие циклов проектирования-строительства-тестирования-обучения, автоматизированных с помощью робототехники для обработки жидкости и микрофлюидики, ускоряет этот процесс.

Инструменты для проектирования и создания генетических схем

Программная помощь и моделирование

Несколько инструментов автоматизированного проектирования (CAD) были созданы специально для генетических схем. Cell Designer, GenoCAD и SBOL (Synthetic Biology Open Language) фреймворк позволяют исследователям составлять схемы из стандартизированных частей и моделировать их поведение с использованием обычных дифференциальных уравнений. Модели машинного обучения, обученные на больших наборах данных охарактеризованных комбинаций промотор-RBS-репрессор, теперь могут прогнозировать устойчивый выход схемы с разумной точностью — важный шаг к рациональному, а не пробному и ошибочному дизайну.

Методы сборки ДНК

После того, как схема спроектирована в силико, она должна быть физически собрана. Такие методы, как Золотые ворота и Гибсон сборка , позволяют без рубцов соединить несколько фрагментов ДНК в одной реакции. Для более крупных, многокомпонентных схем, дрожжевая гомологичная рекомбинация или сборка на основе CRISPR означает, что снижение стоимости коммерческого синтеза генов (до нескольких центов на базовую пару) означает, что многие лаборатории теперь просто заказывают всю цепь как пользовательский фрагмент гена, сокращая время строительства от недель до дней.

Будущие направления: более умные и надежные схемы

Ортогональные системы экспрессии

Одним из перспективных направлений является использование ортогональных рибосом и ортогональных РНК-полимераз (например, T7 РНК-полимеразы), которые не взаимодействуют с нативным механизмом хозяина. Секвестрируя экспрессию цепи на ортогональную систему, инженеры могут избежать перекрестных разговоров с метаболизмом хозяина и улучшить стабильность цепи. Ортогональные рибосомы также могут быть спроектированы для чтения «неестественных» кодонов, расширяя генетический код для производства неканонических аминокислот.

CRISPR-основанные схемы

Помехи CRISPR (CRISPRi) и активация CRISPR (CRISPRa) стали мощными инструментами для построения генетических цепей. белок dCas9, слитый с репрессорным доменом, может управляться с помощью спроектированной направляющей РНК для блокирования транскрипции в любом промоторе — нет необходимости в пользовательских репрессорных белках. Схемы на основе CRISPR могут быть легко перепрограммированы путем замены направляющих РНК-последовательности, и они могут быть мультиплексированы для управления многими генами одновременно. Эта модульность резко сокращает цикл проектирования для регуляции пути производства.

Системы без клеток для быстрого прототипирования

Не все биохимические производства нуждаются в живых клетках. Системы экспрессии без клеток (например, экстракты TX-TL) позволяют тестировать генетические схемы в пробирке в течение нескольких часов, без осложнений роста клеток, мутации и токсичности. Эти системы все чаще используются для прототипирования путей производства и оптимизации параметров схемы перед передачей конструкции живому хозяину. По мере расширения производства без клеток (например, для синтеза белковой терапии по требованию), разработка генетических схем, которые функционируют в экстракте, сама станет ценным промышленным навыком.

Интеграция с машинным обучением и автоматизацией

Объем данных, генерируемых автоматизированными рабочими процессами с использованием тензоинженерии, огромен. Алгоритмы машинного обучения теперь могут рекомендовать схемы, прогнозировать оптимальные концентрации индукторов и даже предлагать новые комбинации промоторов-RBS, которые еще не были протестированы. В сочетании с роботизированными литейными заводами, подключенными к облаку (например, концепция «BioFab» Консорциума исследований инженерной биологии), цикл испытаний проектирования-строительства может выполнять сотни итераций в неделю, быстро сходящихся на высокопроизводительных схемах для любой конкретной биохимической цели.

Заключение

Генетическая схема проектирования эволюционировала от любопытства синтетической биологии в практический инструмент для оптимизации биохимических производственных путей. Путем обеспечения динамического контроля уровней ферментов, подавления побочных продуктов и надежной долгосрочной стабильности, хорошо спроектированные схемы могут удвоить или утроить выходы при одновременном снижении затрат и отходов. Продолжающееся развитие стандартизированных частей, вычислительного моделирования, ортогональных систем и регуляторов на основе CRISPR снижает барьер для входа и расширяет диапазон соединений, которые могут быть экономически произведены путем ферментации. Для любого, кто участвует в метаболической инженерии - будь то в академических кругах или промышленности - овладение принципами генетической схемы проектирования больше не является обязательным. Это ключ к раскрытию полного потенциала живых клеток как химических заводов.

Дополнительное чтение: Для отличного праймера по инструментам синтетической биологии см. Фонд BioBricks. Всесторонние ресурсы по моделированию схем доступны по SBOL Standard. Для тематических исследований в области метаболической инженерии обзорные статьи в Nature Biotechnology предоставляют регулярные обновления.