Влияние жесткости каркаса на хондрогенную дифференциацию и качество хряща
Регенерация функционального суставного хряща остается постоянной клинической проблемой. Травма, остеоартрит и врожденные дефекты часто приводят к поражениям, которые, не будучи обработанными, прогрессируют до дегенерации суставов и боли. Тканевая инженерия возникла как многообещающая терапевтическая стратегия, опираясь на триаду клеток, факторы роста и каркасы. Среди них каркас служит временной внеклеточной матрицей (ЭКМ), которая обеспечивает структурную поддержку, направляет поведение клеток и в конечном итоге деградирует, чтобы быть замененной родной тканью. В то время как много внимания уделялось химии каркаса, пористости и скорости деградации, одним из параметров, который глубоко влияет на регенеративные результаты, является жесткость каркаса. Механические свойства каркаса непосредственно влияют на то, как клетки чувствуют и реагируют на их микросреду, процесс, известный как механотрансдукция. Эта статья синтезирует современное понимание того, как жесткость каркаса влияет на хондрогенную дифференцировку и качество инженерного хряща, обеспечивая понимание для проектирования улучшенных биоматериалов для восстановления хряща
Понимание жесткости Scaffold
Жесткость каркаса, формально определяемая упругим модулем (модуль Юнга), количественно определяет устойчивость материала к деформации под нагрузкой. В контексте тканевой инженерии жесткость охватывает широкий диапазон от мягких гидрогелей (< 1 kPa) to rigid polymer scaffolds (>] 100 МПа. Жесткость нативного суставного хряща проявляет глубинозависимое смещение: поверхностные зоны более мягкие (приблизительно 0,5-5 МПа при сжатии), в то время как глубокая зона более жесткая (приблизительно 5-20 МПа), при этом общий сжимающий модуль здорового хряща находится в диапазоне от 0,5 до 2 МПа в средней зоне. Однако клетки испытывают местную жесткость на микромасштабе, которая может быть намного ниже, чем объемные механические свойства из-за гидратированной природы хряща ECM. Поэтому жесткость каркаса обычно настроена на имитацию жесткости перицеллюлярного матрикса, которую естественным образом испытывают хондроциты, по оценкам, в диапазоне 1-30 кПа для хрящевой
Измерение жесткости каркаса осуществляется с помощью таких методов, как атомно-силовая микроскопия (AFM) для микромасштабной характеристики, динамический механический анализ (DMA) для объемных свойств и наноиндентация. Общие каркасные материалы включают природные полимеры, такие как коллаген, гиалуроновая кислота, альгинат и желатиновый метакрилоил (GelMA), а также синтетические полимеры, такие как поликапролактон (PLGA) и полиэтиленгликоль (PEG). Гибридные композиты, которые объединяют материалы различной жесткости, также используются для достижения градуированных механических свойств. Способность точно контролировать жесткость - через плотность сшивания, концентрацию полимера или молекулярную массу - представляет собой критический параметр конструкции для влияния на судьбу стволовых клеток.
Влияние на хондрогенную дифференциацию
Жесткость каркаса оказывает доминирующее влияние на дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток (МКС) по отношению к хондрогенной линии. Пути механотрансдукции преобразуют физические сигналы из каркаса во внутриклеточную биохимическую сигнализацию. Ключевые медиаторы включают интегралы, очаговые спайки, актин цитоскелет и транскрипционные коактиваторы, такие как YAP/TAZ. Как правило, МСК, культивируемые на мягких матрицах (0,1-10 кПа), которые имитируют нативный хрящевой микроокружение, как правило, принимают хондроцитоподобный фенотип, в то время как более жесткие субстраты (10-40 кПа) способствуют остеогенезу или миогенезу. Однако связь не просто линейна; оптимальная жесткость для хондрогенеза лежит в узком окне, которое также зависит от типа клетки и наличия хондрогенных факторов, таких как TGF-β.
Механизмы хондрогенеза, основанного на жесткости
На мягких каркасах пониженное цитоскелетное напряжение приводит к инактивации YAP/TAZ, что позволяет осуществить ядерную транслокацию SOX9, главного транскрипционного фактора хондрогенеза. И наоборот, жесткие каркасы активируют YAP/TAZ, способствуя экспрессии RUNX2 и ведя к остеогенной или гипертрофической дифференциации. Этот переключатель YAP/TAZ представляет собой первичный механизм, посредством которого жесткость каркаса направляет линейное связывание. Кроме того, жесткость влияет на кластеризацию интегринов и формирование очаговых спаек. Мягкие субстраты благоприятствуют слабым, преходящим спайкам, способствующим морфологии круглых клеток, характерной для хондроцитов, тогда как жесткие субстраты способствуют распространению, сплющенным морфологиям, типичным для остеобластов.
Многочисленные исследования систематически варьировали жесткость каркаса и оценивали хондрогенные маркеры. Например, семенное исследование, проведенное Engler et al. , продемонстрировало, что MSC на полиакриламидных гелях промежуточной жесткости (25 кПа) дифференцировалось на остеобласты, в то время как на более мягких гелях (10 кПа) показали миогенный и хондрогенный потенциал. Более поздняя работа, специально сфокусированная на хряще: Zhang et al. , показала, что желатиновые метакрилоилгидрогели с компрессионным модулем 12 кПа поддерживали большую хондрогенную дифференцировку и более высокое осаждение гликозаминогликана (GAG) по сравнению с более мягкими (4 кПа) или более жесткими (20 кПа) гидрогелями. Аналогичным
Избегать гипертрофической дифференциации
Одним из основных препятствий в разработке хрящевой ткани является предотвращение прогрессирования инженерной ткани в направлении гипертрофического фенотипа остеоартрита. Слишком жесткие каркасы могут вызывать сигнализацию Wnt/β-катенина и повышение регуляции коллагенового типа X и матриксной металлопротеиназы 13 (MMP-13), отличительные признаки гипертрофии хондроцитов. Кроме того, жесткие каркасы могут способствовать минерализации ткани, а не стабильному гиалиновому хрящу. Поэтому жесткость каркаса должна быть тщательно откалибрована, чтобы не только инициировать хондрогенез, но и поддерживать хондроцитный фенотип и подавлять гипертрофию. Динамическая настройка жесткости - с использованием материалов, которые смягчаются с течением времени по мере депонирования ECM - представляет собой многообещающую стратегию для имитации естественного процесса развития и поддержания производства хрящевой матрицы.
Влияние на качество хряща
Качество хряща определяется его биохимическим составом, структурной организацией и механическими свойствами.Жесткость каркаса влияет на каждый из этих аспектов, в конечном итоге определяя функциональную эффективность сконструированной ткани для клинического ремонта.
Биохимический состав
Хондроциты и МСК откладывают ECM, богатый коллагеном типа II, аггреканом и другими протеогликанами. Жесткость лесов напрямую влияет на количество и качество этих компонентов. Мягкие к промежуточной жесткости (10-20 кПа) каркасы обычно приводят к более высокому содержанию GAG и коллагена типа II по сравнению с очень мягкими или жесткими субстратами. Например, исследования с использованием гидрогелей гиалуроновой кислоты показали, что гели с модулями 15 кПа дают в 2 раза больше GAG на клетку, чем гели 5 кПа или 30 кПа. Кроме того, распределение матрицы более однородно в оптимально жестких каркасах, тогда как жесткие каркасы часто производят плотную, фиброкартилевидную ECM с повышенным содержанием коллагена типа I и уменьшенным содержанием протеогликанов. Сульфатированное содержание GAG, измеренное методом анализа DMMB или окрашиванием Safranin O, служит надежным показателем качества
Структурная целостность и организация
Нативный суставной хрящ демонстрирует зональную архитектуру с отчетливой ориентацией коллагеновых волокон. В то время как современные каркасы редко повторяют эту сложность, градиенты жесткости могут способствовать анизотропному осаждению ECM. Мягкие каркасы, как правило, поддерживают более случайную, изотропную структуру ECM, тогда как более жесткие каркасы могут стимулировать выравнивание коллагеновых волокон в направлении механической нагрузки. Однако чрезмерная жесткость может вызвать ECM, который слишком плотный и плохо организованный, с уменьшенной проницаемостью тканей и переносом питательных веществ. Идеальная жесткость каркаса уравновешивает пористость и механическую целостность, чтобы обеспечить равномерное посев клеток, диффузию питательных веществ и постепенное образование организованной ECM, которая может интегрироваться с окружающим хрящом.
Механические свойства инженерной ткани
Конечная цель разработки хряща - создать ткань, которая может выдерживать механические требования совместной нагрузки. Жесткость лесов влияет не только на начальную прочность конструкции, но и на механическое созревание неотиссуи. Промежуточная жесткость каркасов производит хрящ с значениями модуля сжатия, приближающимися к значениям нативной ткани (0,5-2 МПа после нескольких недель культивирования). Напротив, конструкции на очень мягких каркасах не имеют достаточной механической целостности, чтобы противостоять деформации, в то время как жесткие каркасы могут подавлять ремоделирование матрицы, опосредованное клетками, в результате чего конструкция, которая остается опосредованной каркасом, а не доминирует над тканью. Оптимизированная жесткость поддерживает достаточную начальную несущую способность, позволяя клеткам постепенно заменять каркас механически надежной ECM.
Ключевые факторы, которые следует учитывать при проектировании жесткости каркаса
При выборе или проектировании жесткости каркаса для регенерации хряща необходимо учитывать несколько взаимосвязанных факторов. Эти параметры не являются независимыми, и компромиссы часто требуют тщательной оптимизации.
Упругий модуль, соответствующий родному хрящу
Упругий модуль каркаса должен идеально соответствовать жесткости зоны нацеливания хряща. Для поверхностного восстановления зоны может быть подходящим более мягкий каркас (~0,5-2 МПа объемного модуля), в то время как для более глубоких дефектов более жесткие каркасы, имитирующие глубокую зону (~5-20 МПа), могут быть благоприятными. Однако клетки в первую очередь ощущают местную микросреду на нано- и микромасштабе, поэтому каркасы на основе гидрогеля с модулями в килопаскальном диапазоне часто превосходят высокомодульные полимерные каркасы для хондрогенеза. Соответствие жесткости микромасштаба перицеллюлярной матрице (~1-30 кПа) является более важным принципом проектирования, чем соответствие жесткости суставного хряща насыпи.
Биосовместимость и биоразлагаемость
Материалы каркаса должны быть биосовместимыми, нетоксичными и поддерживать адгезию и пролиферацию клеток. Природные полимеры (коллаген, гиалуроновая кислота, желатин) обеспечивают присущую биоактивность, но могут иметь ограниченную настраиваемость жесткости и быструю деградацию. Синтетические полимеры (PEG, PLGA, PCL) обеспечивают точный контроль жесткости и скорости деградации, но часто требуют поверхностной функционализации для прикрепления клеток. Кинетика деградирования должна быть синхронизирована с осаждением ECM, чтобы избежать преждевременной потери механической поддержки или накопления побочных продуктов деградации. Жесткость часто уменьшается по мере деградации каркаса, что может быть полезно, если новый ECM постепенно берет на себя механическую функцию.
Пористость, размер пор и диффузия питательных веществ
Пористость и размер пор должны быть сбалансированы с жесткостью. Высоко пористые каркасы облегчают проникновение клеток, диффузию питательных веществ и удаление отходов, но повышенная пористость обычно снижает жесткость. Для конструирования хряща обычно рекомендуются взаимосвязанные поры диаметром 100-300 мкм. Более жесткие материалы могут поддерживать адекватную пористость, тогда как очень мягкие гидрогели могут разрушаться под собственным весом, если они очень пористые. Стратегии, такие как включение жертвенных порогенов или изготовление структур градиентной жесткости, могут решить этот компромисс.
Взаимодействие клеточных каркасов и сигнальные пути
Жесткость каркаса влияет на адгезию, распространение и механосигналирование клеток. Плотность интегринсвязывающих лигандов (например, RGD-последовательности) также модулирует эффект жесткости. Более высокая плотность лиганда может в некоторой степени компенсировать низкую жесткость, но комбинация жесткости и плотности лиганда определяет общий прием механических сигнальных клеток. Включение биомиметических мотивов, которые активируют специфические пути (например, TGF-β-связывающие последовательности) может дополнительно усилить хондрогенез. Кроме того, вязкоупругие свойства каркаса, такие как релаксация стресса и ползучесть, влияют на поведение клеток; каркасы, которые рассеивают энергию (вискоупругие), могут способствовать хондрогенезу лучше, чем чисто эластичные материалы при той же жесткости.
В Vivo Host Response и интеграция
Жесткость каркаса также влияет на иммунный ответ хозяина. Жесткие каркасы могут провоцировать реакцию инородного тела, с поляризацией макрофагов в сторону провоспалительного фенотипа M1, тогда как более мягкие каркасы, как правило, вызывают прорегенеративный ответ M2. Для успешного клинического перевода каркас должен быть спроектирован так, чтобы минимизировать хроническое воспаление, поддерживая врастание клеток-хозяев и интеграцию с окружающими хрящевыми и субхондральными костями. Градиенты жесткости на интерфейсе костно-хрящевой ткани могут помочь направить остеогенез в фазу кости и хондрогенез в фазу хряща остеохондральных каркасов.
Будущие направления и клинический перевод
Несмотря на значительный прогресс, перевод оптимизированных по жесткости лесов в клиническую терапию сталкивается с несколькими проблемами. Большинство исследований было проведено in vitro или на моделях мелких животных, и масштабирование до дефектов размером с человека со сложными профилями загрузки остается трудным. Подложки клинического класса также должны соответствовать нормативным требованиям безопасности, стерильности и воспроизводимости.
Новые подходы включают использование 4D-печати для создания каркасов с зависящими от времени изменениями жесткости, что позволяет материалу изначально быть достаточно жестким для хирургического лечения, а затем смягчаться для содействия хондрогенезу. Градиентные каркасы жесткости , изготовленные с помощью микрофлюидики или последовательной фотополимеризации, могут генерировать зональную архитектуру, имитирующую нативную остеохондральную ткань. Динамические культуры , которые применяют контролируемую механическую нагрузку на каркас во время созревания, могут дополнительно повысить качество матрицы. Кроме того, механочувствительные системы доставки лекарств системы, которые выделяют хондроиндуктивные факторы, когда каркас испытывает определенные штаммы, могут улучшить результаты.
Другим перспективным направлением является сочетание оптимизации жесткости с биохимическими сигналами. Представление факторов роста, таких как TGF-β1, BMP-7 или FGF-18, зависящим от жесткости, например, посредством ковалентного привязывания или контролируемого высвобождения на основе деградации каркаса, может синергетически усиливать хондрогенез. Кроме того, генно-активированные матрицы, которые доставляют гены, кодирующие хондрогенные факторы транскрипции (например, SOX9), могут обеспечить устойчивые терапевтические эффекты, уменьшая потребность в дорогих рекомбинантных белках.
Наконец, для подтверждения функциональных преимуществ картеля с жесткостью, настроенного каркасом, необходимо тщательное доклиническое тестирование на крупных моделях животных (например, овцах, козах) с дефектами хряща критического размера. Меры по результатам должны включать гистологическую оценку восстановительной ткани (с использованием оценки O'Driscoll или ICRS), биохимическую количественную оценку GAG и коллагена типа II и биомеханическое тестирование сжимающих и сдвигающих модулей регенерированной ткани. Только посредством такой комплексной оценки можно полностью реализовать клинический потенциал конструкций, оптимизированных для жесткости.
Заключение
Жесткость каркаса является ключевым биофизическим параметром, который глубоко влияет на хондрогенную дифференцировку и функциональное качество инженерного хряща. Через пути механотрансдукции клетки интерпретируют сигналы жесткости для связывания с линией хондроцитов, производят специфичные для хряща ECM и сопротивляются гипертрофическому преобразованию. Мягкие к промежуточным субстратам жесткости (~10-20 кПа в шкале восприятия клеток) последовательно связаны с оптимальным хондрогенезом, в то время как чрезмерно жесткие матрицы приводят к остеогенезу или приводят к фиброкартиляжу. Однако жесткость не может рассматриваться изолированно; она должна быть интегрирована с пористостью, кинетикой деградации, биохимическими сигналами и реакциями хозяина in vivo. Будущие конструкции каркаса, которые включают динамическую жесткость, градиенты и механоспонсивные элементы, имеют большие перспективы для создания функциональных замен хряща, которые могут выдерживать требовательную механическую среду ар